高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的研究

于殿宇，馬 鶯，劉 晶，張佳寧，李 琳

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶A1的研究

于殿宇1，2，馬 鶯1，*，劉 晶2，張佳寧2，李 琳1

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150090；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

研究了高碘酸鈉氧化法在纖維素濾紙膜載體上固定化磷脂酶A1的最佳條件。結(jié)果表明，以固定化酶活力為指標(biāo)，當(dāng)高碘酸鈉濃度為0.15mol/L，活化80min，與濃度為0.05g/mL酶的磷酸鹽緩沖溶液（pH為5.8）于戊二醛濃度0.4%、溫度4℃交聯(lián)4h，獲得的固定化磷脂酶A1酶活最高為4.8U/cm2。固定化酶膜的酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度35℃；最適pH為9.0。與游離酶相比，pH向堿性偏移1.0；經(jīng)7次重復(fù)使用后，固定化酶膜活力為原酶活的65%以上。SEM結(jié)果顯示，經(jīng)高碘酸鈉氧化后的纖維素濾紙膜能較好地固定磷脂酶A1。

磷脂酶A1，高碘酸鈉氧化法，固定化，纖維素濾紙膜，酶活

磷脂酶A1是一類(lèi)可以水解磷脂Sn-1位酯鍵獲得2-?；?溶血磷脂和脂肪酸的酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中[1]。游離磷脂酶A1價(jià)格昂貴，不易回收，催化水解時(shí)條件苛刻。磷脂酶A1不僅具有脂肪酶活性，而且還同時(shí)具有磷脂酶活性，但是在一定的反應(yīng)體系中，會(huì)優(yōu)先表現(xiàn)出一種特定的酶活，價(jià)格低廉的磷脂酶A1在工業(yè)上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值[2]。最早將酶法脫膠用于大工業(yè)生產(chǎn)的是德國(guó)Lurgi公司，稱(chēng)為“EnzyMax process”，國(guó)內(nèi)也進(jìn)行了相關(guān)的研究，當(dāng)時(shí)采用的是一種豬胰臟來(lái)源的磷脂酶A2，由于該酶必須以Ca2+為激活劑，且來(lái)源有限，價(jià)格昂貴，而且在脫膠效果上尚存在一些不足，該方法一直未進(jìn)行大規(guī)模推廣。隨后Novozymes公司推出了一種適合油脂脫膠的微生物來(lái)源的磷脂酶A1Lecitase Novo，該酶具有A1位專(zhuān)一性，無(wú)需Ca2+、成本低、來(lái)源廣、生產(chǎn)控制簡(jiǎn)單，非常適合進(jìn)行大工業(yè)推廣[2]。由于直接利用自然酶進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)一般是不可行的，自然酶混溶在反應(yīng)體系中不僅不易分離回收，而且酶的制取一般較困難，且成本高昂，難以反復(fù)或連續(xù)使用，為了解決上述問(wèn)題，固定化酶技術(shù)越來(lái)越受到人們的關(guān)注[3]。固定化酶技術(shù)是通過(guò)物理和/或化學(xué)作用將水溶性的游離酶分子束縛在一定的區(qū)間內(nèi)（通常在非水溶性載體上），用簡(jiǎn)單的分離方法（如離心沉降）即可回收并反復(fù)使用，這樣改良的酶即稱(chēng)為固定化酶。固定化酶的制備、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)及固定化酶反應(yīng)器的研制、生產(chǎn)，是固定化酶體系的主要內(nèi)容[4-6]。固定化酶技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)成為酶工程領(lǐng)域中最為活躍的研究方向之一，因此對(duì)固定化酶的研究也就越來(lái)越多[7-9]。常用的固定化方法主要有四種，即包埋法、交聯(lián)法、吸附法和共價(jià)法[10]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于磷脂酶A1的固定化研究很少，且相關(guān)的應(yīng)用研究主要集中在酶法脫膠方面[11-12]。酶可以通過(guò)吸附法固定在膜上，但吸附法固定的酶不牢固，易流失?；瘜W(xué)交聯(lián)法是通過(guò)共價(jià)鍵達(dá)到載體與酶結(jié)合的目的，因而固定的酶比較牢固。由于表面含有大量的羥基，容易改性而與酶共價(jià)結(jié)合，因此，纖維素是固定化酶的良好載體，被廣泛地應(yīng)用于固定化酶和作為色譜支持物來(lái)分離和純化敏感的生物活性物質(zhì)[13]。本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)固定化酶方法交聯(lián)法固定化磷脂酶A1。由于纖維素濾紙膜的纖維狀較為松散，不利于酶的固定，而且纖維表面沒(méi)有大量的醛基吸附固定酶分子，因此，本實(shí)驗(yàn)先用高碘酸鈉將纖維素濾紙膜氧化后，再進(jìn)行酶的固定化。由于高碘酸鈉具有一定的氧化作用，可將纖維素濾紙膜表面的羥基氧化成醛基，因此，采用高碘酸鈉氧化活化后的纖維素濾紙膜作為固定化磷脂酶A1的載體，以確定最佳的高碘酸鈉氧化濃度及活化時(shí)間、酶液添加濃度及戊二醛使用濃度和交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間等固定化因素；最后，在反應(yīng)的過(guò)程中確定了最佳的固定化磷脂酶A1條件，并由SEM掃描進(jìn)一步驗(yàn)證了固定化酶膜有較好的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Lipase Ultral磷脂酶A1諾維信公司；粉末磷脂 天津博帥工貿(mào)有限公司；高碘酸鈉、氫硼化鈉 分析純，廣東東莞市大嶺山公司；磷酸氫二鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；檸檬酸 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；聚乙烯醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑 均為分析純。

磁力攪拌器85-2型 江蘇中大儀器廠；LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京市醫(yī)用離心機(jī)廠；電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高碘酸鈉氧化法[14-15]取一張膜懸浮于10mL不同濃度的高碘酸鈉溶液中，室溫下置于搖床中搖動(dòng)一定時(shí)間，取出立即用去離子水洗至中性，吸干水分，與酶的磷酸鹽緩沖溶液于28℃進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)反應(yīng)后取出，懸浮于10mL 1%氫硼化鈉溶液中，于4℃反應(yīng)30min，然后用2mol的KCl（氯化鉀）溶液和水分別洗滌三次，取出測(cè)定酶活。

1.2.2 游離磷脂酶酶活測(cè)定[16]測(cè)定固定化酶酶活時(shí)將已固定化酶的濾紙剪碎，平均分成兩份，其中一份做空白，余下部分與游離酶測(cè)定方法一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 高碘酸鈉氧化法固定化磷脂酶的影響因素

2.1.1 高碘酸鈉的濃度和活化時(shí)間的確定 考察了在不同濃度的高碘酸鈉氧化作用下活化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響，如圖1所示。

圖1 不同高碘酸鈉濃度下活化時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effect of activated under the different NaIO4 concentrations on activity of immobilized PLA1

由圖1可知，當(dāng)NaIO4（高碘酸鈉）濃度為0.15mol/L，活化時(shí)間為80min時(shí)，所獲得的固定化酶的酶活最高，而隨著活化時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶的活力減弱。氧化程度通常由膜表面上的羥基被氧化成醛基的量來(lái)表示。由于纖維素濾紙膜表面有大量的羥基，易于高碘酸鈉氧化羥基成醛基，利于下一步的交聯(lián)反應(yīng)，因此選擇高碘酸鈉濃度為0.15mol/L，活化時(shí)間為80min時(shí)最佳。

2.1.2 磷脂酶A1濃度的確定 將氧化活化后的纖維素濾紙膜懸浮于不同酶濃度的磷酸鹽緩沖液中，于4℃進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，考察了不同酶液濃度對(duì)固定化酶活力的影響，如圖2所示。

圖2 酶液濃度對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of free enzyme concentrations on activity of immobilized PLA1

由圖2可知，隨著磷脂酶液濃度的增加，酶活力逐漸增加，當(dāng)酶液濃度為0.05g/mL時(shí)，酶活力最高，再繼續(xù)增大酶液濃度反而使酶活力降低，所以選擇酶液濃度為0.05g/mL為最佳。

2.1.3 戊二醛濃度的確定 選擇不同濃度的戊二醛作為交聯(lián)劑，考察了不同交聯(lián)劑濃度對(duì)固定化酶活力的影響，如圖3所示。

由圖3可知，隨著戊二醛濃度增加，固定化酶活力先增加，后降低。這是因?yàn)槲於舛仍黾訒r(shí)，戊二醛和磷脂酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，酶流失減少，所以活力也隨之增加；但進(jìn)一步增加戊二醛濃度將導(dǎo)致酶活力下降，這是因?yàn)槊阜肿踊钚曰鶊F(tuán)被戊二醛過(guò)多的修飾，導(dǎo)致酶活力降低，所以戊二醛的最佳濃度為0.4%。

2.1.4 交聯(lián)時(shí)間的確定 以不同交聯(lián)時(shí)間來(lái)對(duì)酶進(jìn)行固定化，考察了不同固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響，如圖4所示。

圖3 戊二醛濃度對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effect of glutaraldehude concentration on activity of immobilized PLA1

圖4 交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of the time of cross-linking on activity of immobilized PLA1

由圖4可知，隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶的活力呈升高趨勢(shì)，在4h時(shí)達(dá)到峰值；此后延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，固定化酶的酶活力反而降低，這是由于酶的失活所致。因此，確定理想的交聯(lián)時(shí)間為4h。

2.2 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化酶的最適溫度 纖維素濾紙膜在高碘酸鈉濃度為0.15mol/L，活化80min，與濃度為0.05g/mL的酶的磷酸鹽緩沖溶液（pH為5.8）于戊二醛濃度0.4%，溫度4℃下，交聯(lián)4h時(shí)，固定化磷脂酶效果最好。在該條件下固定化磷脂酶，分別在不同溫度條件下測(cè)定酶活，如圖5所示。由圖5可知，固定化酶與游離酶的最適反應(yīng)溫度均為35℃，與游離酶相比固定化酶膜的最適反應(yīng)溫度沒(méi)有明顯變化，并且它在50℃時(shí)所表現(xiàn)的酶活力仍然比較穩(wěn)定，說(shuō)明固定化酶最適溫度范圍變寬。因此，固定化酶酶活變化較游離酶小，固定化酶比游離酶穩(wěn)定，不易失活。

圖5 溫度對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on activity of PLA1

2.2.2 固定化酶的最適pH 選擇不同的反應(yīng)pH，按固定化酶最佳的固定化條件進(jìn)行固定化磷脂酶A1，

在最佳條件下測(cè)定固定化磷脂酶活力并與游離磷脂酶進(jìn)行比較，如圖6所示。

圖6 pH對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on relative activity of immobilized lipase and free lipase

由圖6可知，游離磷脂酶的最適pH為8.0，固定化磷脂酶的最適pH為9.0，向堿性偏移1.0。固定化酶的最適pH為9.0，顯示固定化酶比游離酶較耐堿，且固定化后的磷脂酶的pH變化范圍不大。

2.2.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性 以5%粉末磷脂為底物，進(jìn)行酶解反應(yīng)，分別在相同條件下連續(xù)進(jìn)行7批次操作，測(cè)定其酶活力，以第一批次酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)活力，結(jié)果如圖7所示。

圖7 重復(fù)使用次數(shù)對(duì)固定化酶相對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of repeated use frequency on relative activity of immobilized lipase

由圖7可知，固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性，在連續(xù)使用7個(gè)批次后其相對(duì)活力仍保持65%以上。

2.3 SEM圖的研究

采用本試驗(yàn)優(yōu)化出的固定化條件將磷脂酶A1固定在纖維素濾紙膜上，用SEM對(duì)固定化后的磷脂酶A1進(jìn)行掃描，如圖8所示。

圖8 SEM圖像Fig.8 SEM images

由圖8可知，左右兩圖分別為高碘酸鈉氧化后的纖維素濾紙膜和固定化酶酶表面結(jié)構(gòu)的SEM圖。由圖像對(duì)比可知：左圖中經(jīng)氧化后的纖維素濾紙膜較為松散，呈纖維狀，因此有較大的空間來(lái)負(fù)載酶；右圖是將磷脂酶A1固定在纖維素濾紙膜表面制成的固定化酶膜，從圖中可看出用纖維素濾紙膜來(lái)固定磷脂酶，膜表面負(fù)載了部分酶，但由于氧化后的纖維素濾紙膜的羥基被氧化成醛基，所以酶被很好地固定在膜上。因此，進(jìn)一步驗(yàn)證了將酶固定在膜上更有利于酶的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了高碘酸鈉氧化法在纖維素濾紙膜載體上固定化磷脂酶A1的最佳條件。采用高碘酸鈉氧化法優(yōu)化后固定化條件為：以固定化酶活力為指標(biāo)，當(dāng)高碘酸鈉濃度為0.15mol/L，活化80min，與濃度為0.05g/mL的酶的磷酸鹽緩沖溶液（pH為5.8）于戊二醛濃度0.4%，溫度4℃下，交聯(lián)4h，獲得的固定化磷脂酶A1酶活力最高為4.8U/cm2。由于本試驗(yàn)采用高碘酸鈉氧化法氧化固定化酶載體纖維素濾紙膜，而通常氧化程度以濾紙表面的羥基被氧化成醛基的量表示，醛基含量越高，與酶的交聯(lián)率越大，以致所得到的固定化酶的活力較常規(guī)固定化方法有所提高。將固定化后的磷脂酶與游離磷脂酶的活力進(jìn)行比較，固定化后的磷脂酶的pH變化范圍不大，且對(duì)溫度的敏感性更穩(wěn)定，最適pH為9.0，最適溫度為35℃，而經(jīng)7次重復(fù)使用后，固定化酶膜活力為原酶活的65%以上，說(shuō)明固定化酶膜有較好的穩(wěn)定性。進(jìn)一步對(duì)固定化后的磷脂酶A1穩(wěn)定性進(jìn)行SEM掃描驗(yàn)證，SEM結(jié)果顯示：高碘酸鈉氧化后的纖維素濾紙膜表面的纖維枝狀大部分被酶覆蓋，且酶堆積的非常致密，表明大部分酶滯留在纖維素濾紙膜的界面上，這種結(jié)構(gòu)較利于磷脂酶的固定化。

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Study on immobilization of phospholipase A1by sodium periodate oxidation

YU Dian-yu1，2，MA Ying1，*，LIU Jing2，ZHANG Jia-ning2，LI Lin1
（1.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China；2.College of Food Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The phospholipase A1was immobilized on the cellulose membrane carrier by sodium periodate oxidation and the different influential factors of immobilization condition on the catalytic activity of phospholipase A1were studied.The optimal conditions of the immobilized lipase：the sodium periodate concentration was 0.15mol/L，activated 80min，which the lipase concentration was 0.05g/mL under the phosphate buffered solution with pH5.8 under 4℃，crosslinking for 4h.The phospholipase A1activities was 4.8U/cm2.The immobilized lipase characterization：the optimal temperature for the immobilized lipase was 35℃；the optimal pH was 9.0，which drifted 1.0 to the alkaline side than that of free lipase；the immobilized lipase membrane was used for 7 times still with high activity above 65%.The results of SEM images showed that cellulose membrane could better immobilize lipase.

phospholipase A1；sodium periodate oxidation；immobilization；cellulose membrane；activity of lipase

TS201.2

A

1002-0306（2012）07-0188-04

2011－06－22 * 通訊聯(lián)系人

于殿宇（1964-），男，教授，在讀博士，主要從事大豆油脂加工技術(shù)研究。

國(guó)家863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（2010AA101503）。