黑曲霉脂肪酶合成單月桂酸甘油酯

鄧穎穎，楊 哪，徐學(xué)明，2，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

黑曲霉脂肪酶合成單月桂酸甘油酯

鄧穎穎1，楊 哪1，徐學(xué)明1，2，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122)

從黑曲霉中提出了一種具有很高催化活性和選擇性的脂肪酶，為證明這種脂肪酶的高選擇性，用此酶直接催化甘油和月桂酸反應(yīng)合成單月桂酸甘油酯，并且優(yōu)化了反應(yīng)的工藝參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明，采用甘油月桂酸摩爾比為1∶1.5，脂肪酶與底物質(zhì)量比為0.5%，水與底物質(zhì)量比為3%的條件在50℃下反應(yīng)12h，可使月桂酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到91.2%，單酯含量高達(dá)70%。

黑曲霉脂肪酶，月桂酸單甘酯，合成

脂肪酸單甘酯是一種高效的表面活性劑，能夠起乳化、起泡、分散、消泡、淀粉抗老化等作用，廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，是食品中應(yīng)用最為廣泛的一種乳化劑[1]。脂肪酸單甘酯的合成方法主要有化學(xué)法和酶法。與化學(xué)合成法[2-3]相比，酶法反應(yīng)條件溫和、能耗低、選擇性高，具有工業(yè)化潛力。酶法合成主要有兩種途徑：一是用脂肪酶甘油解牛油、棕櫚油等[4]，但單甘酯含量不超過30%，且反應(yīng)周期長，產(chǎn)品純化處理極其困難；二是用脂肪酶直接催化脂肪酸或酯與甘油反應(yīng)，但很多酶[5-6]選擇性很差，產(chǎn)物中單酯含量不高，Novozyme435[7-9]雖然具有很好的選擇性，但是價(jià)格昂貴，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。目前酶法合成存在的問題主要是酶的選擇性差，單酯產(chǎn)量不高；或者昂貴，很難商業(yè)化。因此，尋找選擇性高、能商業(yè)化生產(chǎn)的酶是酶法合成脂肪酸單甘酯的研究重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室從黑曲霉中提取的脂肪酶經(jīng)初步實(shí)驗(yàn)證明具有很強(qiáng)的催化活性和選擇性，是合成脂肪酸單甘酯的有效催化劑。本文以此酶催化月桂酸和甘油反應(yīng)，以證明它的高活性和選擇性，并對反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，為工業(yè)化酶法生產(chǎn)高含量單酯提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

黑曲霉脂肪酶（比酶活：60.3U/mg） 實(shí)驗(yàn)室；月桂酸、甘油、無水乙醚、無水乙醇、氫氧化鈉、高碘酸、硫代硫酸鈉 中國醫(yī)藥集團(tuán)上海公司，分析純。

8S-1型磁力攪拌器 江蘇省金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；501型超級恒溫水浴鍋 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠；分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；島津20AT液相色譜儀 Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶催化酯化反應(yīng) 稱取約5.32mmol月桂酸，加入一定量的甘油于100mL的酶反應(yīng)器中，再加入所需要的水，在50℃下攪拌0.5h，至反應(yīng)物混合均勻時(shí)加入一定量的酶進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2 月桂酸轉(zhuǎn)化率的測定[7]反應(yīng)結(jié)束后，從反應(yīng)混合物中取樣0.1g左右（精確到0.1mg），并用10mL溶劑（無水乙醇∶無水乙醚=2∶1）溶解，用0.05mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定殘余的脂肪酸，計(jì)算脂肪酸轉(zhuǎn)化率。

式中：m1、m2為反應(yīng)前、后稱取的樣品質(zhì)量（g）；V1、V2為反應(yīng)前、后滴定所用氫氧化鈉的量（mL）。

1.2.3 單月桂酸甘油酯含量的測定[10]反應(yīng)結(jié)束后，從中取出0.07～0.1g（精確到0.2mg）反應(yīng)物，用25mL氯仿將其溶解，在過量高氯酸的存在下，用高碘酸-硫代硫酸鈉氧化還原滴定，測定出總甘油單酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中：M為單月桂酸甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；V0為滴定空白所用硫代硫酸鈉的量（mL）；V1為滴定樣品所用硫代硫酸鈉的量（mL）；C為硫代硫酸鈉濃度（mol/L）；G為稱取樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.4 液相色譜分析[11]色譜柱：Welch Vltimate AQC18（5μm，250mm×4.6mm，i.d）；檢測器：Waters 2410型示差折光檢測器。稱取100mg樣品溶于10mL有機(jī)溶劑中（甲醇∶正己烷=90∶10），經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，作為分析樣品，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相為甲醇∶正己

烷（90∶10，V∶V），流速0.5mL/min，柱溫34℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)產(chǎn)物的組分分析

甘油月桂酸摩爾比為1∶1，脂肪酶與底物質(zhì)量比為1%，水與底物質(zhì)量比為3%，在60℃下反應(yīng)16h得到的產(chǎn)物用液相色譜分析，結(jié)果如圖1、圖2所示。由圖1～圖2可知該酶能較好地合成單月桂酸甘油酯（7.438min）和少量的月桂酸二酯（11.034min），選擇性好。

圖1 單月桂酸甘油酯標(biāo)樣的HPLC圖Fig.1 HPLC of standard lauric acid monoglyceride

圖2 單月桂酸甘油酯樣品的HPLC圖Fig.2 HPLC of synthetic lauric acid monoglyceride

2.2 甘油月桂酸摩爾比對月桂酸轉(zhuǎn)化率的影響

為考察甘油與月桂酸摩爾比對月桂酸轉(zhuǎn)化率的影響，選取脂肪酶與反應(yīng)底物質(zhì)量（甘油和月桂酸總質(zhì)量）比0.5%、溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間12h、初始水量與反應(yīng)底物質(zhì)量比3%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察不同甘油月桂酸摩爾比對反應(yīng)的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3 甘油月桂酸摩爾比對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of ratio of glycerol to lauric acid on conversion rate

月桂酸單甘酯的合成過程是界面反應(yīng)，從化學(xué)平衡看，底物摩爾比增加對底物的最終轉(zhuǎn)化率無明顯影響，并且，底物摩爾比的增加對最終產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)生不利影響。由圖3可知，隨甘油月桂酸摩爾比的增加，月桂酸的轉(zhuǎn)化率無明顯變化，最終的轉(zhuǎn)化率都可達(dá)到90%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論相符。在本實(shí)驗(yàn)中，甘油和月桂酸的摩爾比為1∶1.5時(shí)，底物濃度相對于酶的活性中心已經(jīng)過量，達(dá)到了較高的轉(zhuǎn)化率，故以后實(shí)驗(yàn)中均選取甘油月桂酸摩爾比為1∶1.5。

2.3 反應(yīng)時(shí)間對月桂酸轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響

在甘油月桂酸摩爾比1∶1.5、脂肪酶與反應(yīng)底物質(zhì)量比0.5%、初始水量與反應(yīng)底物質(zhì)量比3%，在50℃的條件下進(jìn)行反應(yīng)，考察不同反應(yīng)時(shí)間下的月桂酸轉(zhuǎn)化率及單酯含量。結(jié)果如圖4所示。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響Fig.4 Effect of reaction time on conversion rate and content of lauric acid monoglyceride

由圖4可知，隨著時(shí)間的延長，月桂酸轉(zhuǎn)化率在不斷增大，在12h時(shí)月桂酸轉(zhuǎn)化率已經(jīng)達(dá)到90.2%，12h到20h之間月桂酸轉(zhuǎn)化率沒有明顯變化；單酯含量隨時(shí)間延長也在不斷增大，12h時(shí)達(dá)到最大值71.4%。

2.4 反應(yīng)溫度對月桂酸轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響

在甘油月桂酸比1∶1.5、脂肪酶與反應(yīng)底物質(zhì)量比0.5%、反應(yīng)時(shí)間12h、初始水量與反應(yīng)底物質(zhì)量比3%條件下，研究溫度對轉(zhuǎn)化率及單酯含量的影響。結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on conversion rate and content of lauric acid monoglyceride

由圖5表明，反應(yīng)溫度對月桂酸轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響很大，在酶的穩(wěn)定范圍之內(nèi)，升溫能加快反應(yīng)進(jìn)程，但溫度過高，酶會失活。在反應(yīng)體系中，月桂酸與甘油不能混溶，反應(yīng)是界面反應(yīng)，受傳質(zhì)及底物接觸面積的影響，升高溫度有利于傳質(zhì)，兩種底物同時(shí)與酶接觸的機(jī)會大大增加，有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行。正如圖5所示，轉(zhuǎn)化率和單酯含量隨溫度升高不斷增大，在50℃時(shí)達(dá)到最大值。在80℃時(shí)由于酶的迅速失活，轉(zhuǎn)化率和單酯含量都降低。

2.5 加酶量對月桂酸轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響

利用甘油月桂酸摩爾比1∶1.5、初始水量與反應(yīng)物質(zhì)量比3%、在50℃、反應(yīng)12h的情況下，考察脂肪酶與反應(yīng)底物質(zhì)量比對轉(zhuǎn)化率及單酯含量的影響。結(jié)果如圖6所示。

圖6 脂肪酶與反應(yīng)底物質(zhì)量比對轉(zhuǎn)化率和單酯含量的影響Fig.6 Effect of ratio of lipase to substrates on conversion rate and content of lauric acid monoglyceride

由圖6可知，月桂酸轉(zhuǎn)化率和單酯含量都隨著脂肪酶用量的增大而增大，當(dāng)用量達(dá)到0.5%時(shí)，月桂酸轉(zhuǎn)化率達(dá)90%，單酯含量70%，繼續(xù)增加脂肪酶用量，轉(zhuǎn)化率和單酯含量變化不明顯。

2.6 初始水量對轉(zhuǎn)化率的影響

在甘油月桂酸摩爾比為1∶1.5、脂肪酶與底物質(zhì)量比為0.5%、反應(yīng)時(shí)間12h、55℃的反應(yīng)條件下，研究初始水量與反應(yīng)底物質(zhì)量比對月桂酸轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，起初月桂酸轉(zhuǎn)化率隨初始水量的增加而增大，3%時(shí)到達(dá)最大，隨后轉(zhuǎn)化率有下降的趨勢。這可能是由于脂肪酶催化的酶促反應(yīng)需要適量的水分激活其活性，而酯化反應(yīng)是脫水反應(yīng)，水是產(chǎn)物之一，水分過多會使反應(yīng)提前達(dá)到平衡，使轉(zhuǎn)化率降低。

圖7 初始水量對轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of ratio of water to substrates on conversion rate

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了從黑曲霉中提取的脂肪酶具有很強(qiáng)的催化活性和選擇性，可直接催化甘油和月桂酸合成脂肪酸單甘酯，這種方法工藝過程簡單無污染，成本低，脂肪酸轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物中單酯含量很高，具有很好的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)還確定了反應(yīng)的最佳工藝參數(shù)：甘油月桂酸摩爾比為1∶1.5，脂肪酶與底物質(zhì)量比為0.5%，水與底物質(zhì)量比為3%，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間為12h，此時(shí)月桂酸轉(zhuǎn)化率為91.2%，單酯含量高達(dá)70%。

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Aspergillus niger lipase-catalyzed synthesis of high content lauric acid monoglyceride

DENG Ying-ying1，YANG Na1，XU Xue-ming1，2，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；
2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China）

A lipase from Aspergillus niger has been found with strong catalytic activity and selectivity.In order to prove the lipase high selectivity，it was used to catalyze the fatty acids and glycerin synthetic fatty acid glyceride and optimize the reaction process parameters.The results showed that when the ratio of glycerol to lauric acid 1∶1.5，the lipase dosage 0.5%（W/W），the water dosage 3%（W/W）based on the reactant which was employed in the reacting system，the conversion rate of lauric acid could reach 91.2%at 50℃for 12h reaction. The content of lauric acid monoglycerid was about 70%in the reacting production.

Aspergillus niger lipase；lauric acid monoglyceride；synthesis

Q814.9

A

1002-0306（2012）09-0209-03

2011－07－08 *通訊聯(lián)系人

鄧穎穎（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品物性與組分。