海南新紀(jì)錄種東方蜈蚣藻(紅藻門)的形態(tài)學(xué)觀察和rbcL基因序列分析

張 雯, 王宏偉, 趙 丹, 盛英文, 欒日孝

(1. 遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連自然博物館, 遼寧 大連 116023)

海南新紀(jì)錄種東方蜈蚣藻(紅藻門)的形態(tài)學(xué)觀察和rbcL基因序列分析

張 雯1, 王宏偉1, 趙 丹1, 盛英文1, 欒日孝2

(1. 遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 遼寧 大連 116029; 2. 大連自然博物館, 遼寧 大連 116023)

通過(guò)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察、生殖器官的發(fā)育和rbcL序列分析相結(jié)合的方法, 發(fā)現(xiàn)了分布于海南省陵水新村的東方蜈蚣藻(Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang)為海南新紀(jì)錄種, 該物種具有以下特征： 藻體質(zhì)地凝膠狀或軟骨質(zhì); 皮層外部由5～6層念珠狀的細(xì)胞構(gòu)成, 內(nèi)部由1～2層星形細(xì)胞構(gòu)成; 生殖枝叢由兩個(gè)分枝組成; 果孢子囊分布在除藻體基部外的皮層內(nèi)。

海膜科(Halymeniaceae); 東方蜈蚣藻(Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang); 新紀(jì)錄種;形態(tài)學(xué)觀察; rbcL

蜈蚣藻屬(Grateloupia C.Agardh)隸屬于紅藻門(Rhodophyta)隱絲藻目(Cryptonemiales)海膜科(Halymeniaceae), 由 C.Agardh在 1822年基于Grateloupia ornata C.Agardh, G. hystrix C.Agardh和G. filicina (Lamouroux) C.Agardh這3種建立的,是海膜科最大的一個(gè)屬[1]。屬模為 G.filicina(Lamouroux) C.Ag., 主要特征是藻體直立,淡紅黃色或紫紅色, 黏滑或軟骨質(zhì), 多軸構(gòu)造。分為皮層和髓部, 中央髓部由縱走髓絲錯(cuò)綜交織著,外圍皮層由圓形、橢圓形或不規(guī)則細(xì)胞組成, 背斜排列。有性藻體雌雄同體或異體, 精子囊群由雄配子體的外皮層細(xì)胞形成, 圓柱狀, 無(wú)色。果孢枝與輔助細(xì)胞分別由雌配子體的內(nèi)皮層細(xì)胞產(chǎn)生的枝絲中形成。成熟囊果埋于皮層中, 成顆粒狀, 突出于藻體表面。四分孢子囊由孢子體的外皮層細(xì)胞形成, 十字形分裂[2]。蜈蚣藻屬?gòu)V泛分布于世界各地的沿海, 全世界報(bào)道有約80種[3-10], 中國(guó)共報(bào)道32種[2]。

作者對(duì)海南沿海蜈蚣藻屬資源調(diào)查時(shí), 對(duì)采自海南陵水新村的編號(hào)為 LNU092102和 LNU092103的標(biāo)本進(jìn)行了形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和 rbcL基因序列分析,發(fā)現(xiàn)與2008年林繡美等[11]報(bào)道的產(chǎn)自臺(tái)灣林園的新種東方蜈蚣藻(G. orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang)完全一致, 由于在海南省為首次發(fā)現(xiàn), 因此確認(rèn)該種為海南新紀(jì)錄種。

1 材料與方法

1.1 形態(tài)學(xué)觀察

材料采自海南省陵水新村。分別制作成臘葉標(biāo)本、10%福爾馬林溶液液浸標(biāo)本和硅膠干燥標(biāo)本, 用于形態(tài)觀察、制作冰凍切片和DNA提取。其中, 冰凍切片用 0.5% (w/v)的甲基藍(lán)染色, 并用 Olympus BH2數(shù)字顯微鏡觀察, 用Nikon HFX-ⅡA照相機(jī)拍照記錄結(jié)果。標(biāo)本保存于遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物標(biāo)本室中(LNU)。

1.2 分子序列分析

DNA的提取、PCR擴(kuò)增以及引物設(shè)計(jì)參照Wang等[4]并改進(jìn)的方法。引物組合方式為： (1)F8—R1381-ii, (2)F1—R1150, F735—R1381-ii(表 1)。

從 GenBank 網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)下載并選取了16個(gè)物種的基因序列進(jìn)行rbcL序列分析(表 2), 包括 14個(gè)蜈蚣藻屬(Gratelouopia)的物種, 2個(gè)外群物種(Halymenia floresia, Polyopes constrictus)。MEGA 4.0軟件用于進(jìn)行堿基差異度的分析以及系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建, Bootstrap值為 1000。采用Kimura的雙參數(shù)法計(jì)算距離矩陣[12], 采用NJ(Neighbor-Joining)法和 MP(Maximum Parsimony)法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。

表1 rbcL序列擴(kuò)增所需引物Tab. 1 Primers used for amplifying rbcL sequences

表2 rbcL序列分析所用海藻種類和基因庫(kù)編號(hào)列表Tab. 2 The species used for rbcL sequence analysis and gene number list

2 結(jié)果

2.1 藻體外部形態(tài)

藻體深紅色或棕色, 凝膠狀或軟骨質(zhì), 由 1～15個(gè)圓柱狀或亞圓柱狀的主枝組成, 高達(dá)16 cm, 基部具圓餅狀的固著器, 直徑2～7 mm。單生或數(shù)個(gè)集生在一起, 集生藻體的固著器緊密連接在一起。主枝長(zhǎng)5～12 cm, 常為亞圓柱狀, 直徑 0.7～1.5 mm×2～3 mm,具有不規(guī)則的羽狀分枝, 分枝長(zhǎng) 8～20 mm, 直徑0.2～0.3 mm×0.3～1.5 mm, 配子體和四分孢子體是同型的(圖1a和圖1b)。

圖1 東方蜈蚣藻Fig. 1 External morphology of G.orientalisa. 雌配子體(LNU092102); b. 四分孢子體(LNU092103)a. Female gametophyte (LNU092102); b. Tetrasporic plant (LNU092103)

2.2 內(nèi)部結(jié)構(gòu)

幼體和成熟藻體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有細(xì)微的變化。幼枝內(nèi)部中空, 髓絲松散排列, 外皮層由四到五層念珠狀的細(xì)胞構(gòu)成(圖2a)。隨著分枝直徑的增加, 外皮層細(xì)胞經(jīng)縱向和橫向的分裂, 成為六到八層細(xì)胞, 髓絲伸長(zhǎng)并緊密纏繞在一起, 由次生紋孔聯(lián)系相連接。

圖2 東方蜈蚣藻的橫切面結(jié)構(gòu)和生殖結(jié)構(gòu)(ac代表輔助細(xì)胞)Fig. 2 Transverse section and reproductive structures of G. orientalis.(The ac is auxiliary cell )a. 雌配子體橫切面觀; b～c. 輔助細(xì)胞生殖枝叢切面觀; d～e. 囊果的發(fā)育; f～g. 正在分裂的四分孢子; h. 成熟的四分孢子囊a. Cross-section through a branchlet female gametophyte; b～c. Lateral view of mature auxiliary cell ampulla; d～e. Developing cystocarp;f～g. Dividing tetrasporangium; h. Fully developed tetrasporangium

2.3 生殖結(jié)構(gòu)

果孢枝和輔助細(xì)胞生殖枝叢分別始于基部和近基部的內(nèi)皮層(圖 2b)。輔助細(xì)胞原始生殖枝叢橫向分裂形成一個(gè)長(zhǎng)達(dá)三個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)度的枝絲, 果孢枝和輔助細(xì)胞生殖枝叢繼續(xù)分裂并向外皮層延伸。當(dāng)原始生殖枝叢達(dá)到 5～6個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)度, 次生生殖枝叢的第一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)大, 行使輔助細(xì)胞的功能。受精后, 受精卵核通過(guò)聯(lián)絡(luò)絲從果孢枝生殖枝叢發(fā)出,到輔助細(xì)胞。果孢枝和輔助細(xì)胞生殖枝叢在外形上相同。一個(gè)完整發(fā)育的輔助細(xì)胞生殖枝叢有兩個(gè)分枝, 每個(gè)分枝可達(dá) 7～10個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)度(圖 2b和圖2c)。

輔助細(xì)胞接受了受精卵核后, 經(jīng)橫分裂, 產(chǎn)生一原產(chǎn)孢絲細(xì)胞, 由它連續(xù)斜分裂形成產(chǎn)孢絲基部細(xì)胞?；考?xì)胞繼續(xù)橫分裂, 形成產(chǎn)孢絲。當(dāng)產(chǎn)孢絲聚集到 5～6個(gè)細(xì)胞的時(shí)候, 在輔助細(xì)胞和產(chǎn)孢絲之間的紋孔聯(lián)系擴(kuò)大。接著, 產(chǎn)孢絲基部細(xì)胞與第一次分裂后的輔助細(xì)胞融合, 形成一個(gè)小的融合胞。髓絲和融合胞之間形成次級(jí)紋孔聯(lián)系。產(chǎn)孢絲附近的髓絲逐漸纏繞, 并通過(guò)次級(jí)紋孔聯(lián)系相互連接形成一個(gè)絲狀囊果被, 頂端有時(shí)可以看到一囊孔。產(chǎn)孢絲從末端開(kāi)始成熟, 最后形成為梨形或橢圓形的果孢子囊。成熟囊果中, 產(chǎn)孢絲除基部細(xì)胞外全部形成果孢子囊, 寬 9～10 μm, 長(zhǎng) 11～12 μm(圖 2d-e)。

四分孢子始于內(nèi)皮層細(xì)胞, 十字形分裂(圖2f-h)。成熟的四分孢子囊長(zhǎng) 34～38 μm, 寬 12～15 μm。精子囊母細(xì)胞由表皮細(xì)胞形成, 第一次縱向分裂, 伸長(zhǎng),再橫分裂, 產(chǎn)生精子囊。

2.4 東方蜈蚣藻與其相似種的形態(tài)學(xué)比較

通過(guò)東方蜈蚣藻與其相似種進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征比較(表 3), 可以看出東方蜈蚣藻與繁枝蜈蚣藻較容易分辨： 東方蜈蚣藻具不規(guī)則羽狀分枝; 繁枝蜈蚣藻具不規(guī)則叉狀分枝或互生分枝。東方蜈蚣藻和蜈蚣藻(G. filicina)在外形上較難分辨, 且東方蜈蚣藻曾經(jīng)被當(dāng)作G. filicina[13-14]研究, 但是, 可以通過(guò)其藻體直徑和皮層數(shù)分辨： 東方蜈蚣藻藻體直徑為0.2～0.3 mm×0.3～1.5 mm, 皮層為 6～9 層;G. filicina藻體直徑為350～450 μm, 皮層為5～8層。東方蜈蚣藻與鏈狀蜈蚣藻在外形上極為相似, 很難分辨。

習(xí)性： 生長(zhǎng)在中、低潮帶巖石上或潮下帶0.5～2 m的巖石上。產(chǎn)地： 中國(guó)海南省陵水新村、中國(guó)臺(tái)灣林園模式標(biāo)本產(chǎn)地： 中國(guó)臺(tái)灣林園

表3 東方蜈蚣藻及其近似種的形態(tài)學(xué)比較Tab. 3 Comparison of morphological features between Grateloupia orientalis and its similar species

2.5rbcL分析

全序列比對(duì)結(jié)果如表 4所示。編號(hào)為L(zhǎng)NU092102和 LNU092103的標(biāo)本與東方蜈蚣藻三者之間無(wú)堿基差異, 與屬模蜈蚣藻(G. filicina)的堿基差異為 8.2%(72 bp), 與繁枝蜈蚣藻(G. ramossissima)的堿基差異為 8.3%(73 bp), 與鏈狀蜈蚣藻(G.catenata)的堿基差異為 8.1%(67 bp), 與蜈蚣藻屬內(nèi)其他各種的堿基差異為 8.65%～9.3%(79～91 bp), 與外群(Polyopes lancifolius,Halymenia floresia)的堿基差異為 10.0%～10.4%(118～127 bp)。

圖3 NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 The phylogeny tree based on Neighbor-Joining比例尺為0.01, 表示遺傳距離; 分支上的數(shù)字表示支持率(1000次重復(fù)), 支持率小于50%的沒(méi)有給出Scale bar=0.01 substitutions per site. Numbers at nodes are bootstrap values; the numbers lower than 50% are not shown

圖4 MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 The phylogeny tree based on Maximum Parsimony分支上的數(shù)字表示支持率, 支持率小于50%的沒(méi)有給出Numbers at nodes are bootstrap values; the numbers lower than 50% are not shown

從NJ系統(tǒng)樹(shù)(圖3)和MP系統(tǒng)樹(shù)(圖4)中可以看出, 18個(gè)海膜科的物種聚集為3個(gè)大的進(jìn)化支, 其中,編號(hào)為L(zhǎng)NU092102, LNU092103的標(biāo)本與蜈蚣藻屬內(nèi)的其他各種聚集為一個(gè)大的進(jìn)化支, 與蜈蚣藻屬中的屬模蜈蚣藻(G. filicina)、東方蜈蚣藻(G. orientalis)、繁枝蜈蚣藻(G. ramossissima)、鏈狀蜈蚣藻(G.catenata)形成一個(gè)小分支, 并與東方蜈蚣藻(G. orientalis)組成一個(gè)單獨(dú)的分支, 區(qū)別于其他物種, 其支持率達(dá)100%。

3 討論

蜈蚣藻屬(GrateloupiaC.Agardh)是海膜科(Halymeniaceae)中最大的一個(gè)屬, 其外部形態(tài)變化很大。許多分類學(xué)家都不同程度地對(duì)蜈蚣藻屬做了分類學(xué)研究。

2008年, 林繡美等[11]首次報(bào)道了分布在臺(tái)灣林園的新種東方蜈蚣藻(G. orientalisS.-M. Lin et H.-Y.Liang), 并描述了該種的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。本文采用形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和rbcL基因序列分析相結(jié)合的方法,對(duì)海南沿海蜈蚣藻資源進(jìn)行了調(diào)查, 發(fā)現(xiàn)編號(hào)為L(zhǎng)NU092102和 LNU092103的海藻樣本的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與林繡美報(bào)道過(guò)的東方蜈蚣藻相同, 經(jīng)rbcL基因序列分析, 二者無(wú)堿基差異, 并且在系統(tǒng)樹(shù)上也聚為一個(gè)進(jìn)化支, 因此斷定該種即為東方蜈蚣藻。由于該種只在中國(guó)臺(tái)灣有過(guò)報(bào)道, 在海南省為首次發(fā)現(xiàn), 故將其確定為海南新紀(jì)錄種。

對(duì)該藻進(jìn)行的內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果顯示, 其果孢枝細(xì)胞和輔助細(xì)胞生殖枝叢是典型的蜈蚣藻型,并與東方蜈蚣藻具有相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 藻體質(zhì)地凝膠狀或軟骨質(zhì); 皮層外部由 5～6層念珠狀的細(xì)胞構(gòu)成, 內(nèi)部由1～2層星形細(xì)胞構(gòu)成; 生殖枝叢由兩個(gè)分枝組成; 果孢子囊分布在除藻體基部外的皮層內(nèi);受精后, 產(chǎn)孢絲細(xì)胞鄰近的內(nèi)皮層細(xì)胞, 產(chǎn)生次生髓絲, 最后發(fā)育為囊果被。

通過(guò)東方蜈蚣藻與其相似種的形態(tài)學(xué)特征比較,可以看出東方蜈蚣藻與繁枝蜈蚣藻較容易分辨, 與蜈蚣藻(G. filicina)和鏈狀蜈蚣藻在外形上較難分辨,但與蜈蚣藻(G. filicina)可通過(guò)藻體直徑和皮層數(shù)分辨開(kāi)來(lái)。

rbcL序列分析的結(jié)果顯示, 編號(hào)為L(zhǎng)NU092102和LNU092103的標(biāo)本與東方蜈蚣藻的序列相似度高達(dá)100%, 與其外形相似的繁枝蜈蚣藻、蜈蚣藻以及鏈狀蜈蚣藻的差異為種間差異, 與海膜科內(nèi)海膜屬(Halymenia)和海柏屬(Polyopes)的差異較大, 超過(guò)了種間差異的范圍。在基于rbcL基因(1381 bp)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3和圖4)中可以看出, 該藻與東方蜈蚣藻聚成了一個(gè)單獨(dú)的分支, 區(qū)別于其他種類, 并且, 東方蜈蚣藻與蜈蚣藻屬內(nèi)的其他種形成了一個(gè)大的進(jìn)化支。這不僅證明了該藻與東方蜈蚣藻是同一物種, 也進(jìn)一步驗(yàn)證了東方蜈蚣藻 是蜈蚣藻屬內(nèi)的一個(gè)獨(dú)立的物種。

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Morphological observation and rbcL gene sequence analysis of Grateloupia orientalis (Rhodophyta), a new record of the Hainan province

ZHANG Wen1, WANG Hong-wei1, ZHAO Dan1, SHENG Ying-wen1,LUAN Ri-xiao2
(1. College of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 2. Dalian Natural History Museum, Dalian 116023, China)

Nov.,12,2011

halymeniaceae; Grateloupia orientalis; new record; morphological observations; rbcL

The Grateloupia orientalis S.-M. Lin et H.-Y.Liang collected from Lingshui, Hainan province has been confirmed to be a new record in the Hainan province through morphological observations, development of reproductive structures and molecular phylogenetic studies. This species has the following morphological features：Thallus are gelatinous to cartilaginous in texture; cortex is composed of five to six layers of outer moniliform cells and one to two layers of stellate-shape inner cells; ampullae is composed of only two orders of unbranched filament;carposporangia distribute in all the cortex except the bottom of thallus.

Q943

A

1000-3096(2012)07-0109-08

2011-11-12;

2012-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30870161)

張?chǎng)?1986-) 女, 山東萊蕪人, 碩士研究生, 從事海藻分類學(xué)研究, E-mail： zhangwen111213@126.com; 王宏偉, 通信作者, 教授,博士, 從事海藻分類、多樣性及其分子系統(tǒng)學(xué)研究, E-mail： kitamiwang@yahoo.com.cn

(本文編輯：梁德海)