勞盆地?zé)嵋簢娍诔练e物微生物多樣性初步研究

郭文婷, 劉曉曦, 王 鵬

(同濟(jì)大學(xué) 海洋地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200092)

勞盆地?zé)嵋簢娍诔练e物微生物多樣性初步研究

郭文婷, 劉曉曦, 王 鵬

(同濟(jì)大學(xué) 海洋地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200092)

采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術(shù)對(duì)勞盆地?zé)嵋簠^(qū)TVG9站位沉積物中細(xì)菌、古菌多樣性進(jìn)行了調(diào)查, 并構(gòu)建其細(xì)菌、古菌種群的16S rRNA基因文庫(kù)。研究結(jié)果表明, 該站位細(xì)菌包含變形桿菌(Proteobacteria)、硝化螺旋菌(Nitrospira), 疣微菌(Verrucomicrobia)等3個(gè)類(lèi)群, 其中變形桿菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位, 由Alphaproteobactria, Gamaproteobactria, Deltaproteobactria等 3個(gè)亞群組成。古菌包含泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota), 其中泉古菌占優(yōu)勢(shì),由MGⅠ(Marine GroupⅠ)和MCG(Miscellaneous Crenarchaeotal Group)兩類(lèi)群組成, 而廣古菌主要由MBGE(Marine Benthic Group E)組成。旨在揭示深海熱液區(qū)的微生物多樣性, 為生態(tài)環(huán)境的研究提供理論支持。

勞盆地; 熱液噴口; 沉積物; 微生物多樣性; 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)

1977年人類(lèi)首次在加拉帕戈斯海嶺發(fā)現(xiàn)熱液噴口, 之后在東北太平洋 Juan de Fuca、大西洋中脊Rainbow熱液區(qū)、Lost City熱液區(qū)、印度洋中脊、北冰洋洋中脊等處都有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。深海熱液噴口具有高溫、高壓等特征, 不斷釋放出含有高濃度有毒元素(硫和重金屬)的缺氧熱液羽流, 在與周?chē)浜Ｋ饾u混合過(guò)程中, 呈現(xiàn)出急劇變化的溫度、化學(xué)梯度,為生理、代謝機(jī)制及系統(tǒng)發(fā)育有所不同的微生物提供了巨大的潛在棲息地[1]。熱液噴口是深海極端環(huán)境中的極端, 尤其是其中不依賴(lài)于太陽(yáng)能的黑暗食物鏈的發(fā)現(xiàn), 激發(fā)起人們對(duì)深海生物多樣性及生命起源和進(jìn)化的極大興趣[2-3]。由于傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)手段的局限性及深海生境的特殊性,自沉積物和洋殼中分離得到的微生物數(shù)量非常有限[4-5]。20世紀(jì) 80年代末至90年代, 分子生物學(xué)技術(shù)開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)的分析[6-7]。近年來(lái), 不依賴(lài)培養(yǎng)的16S rRNA基因鑒定技術(shù)揭示出大量先前未被發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的微生物群落[8-9], 使對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行分析成為可能。多種分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用, 還可以彌補(bǔ)單一技術(shù)的不足, 因而成為微生物生態(tài)學(xué)研究中的常見(jiàn)手段[10]。

勞盆地位于西南太平洋湯加島以西, 是殘留島弧(勞海嶺)與活動(dòng)火山弧(Tofua火山弧)之間的一個(gè)弧后盆地, 是第一個(gè)被認(rèn)為由于火山島弧擴(kuò)張形成的年輕海盆[11]。1989年Nautile號(hào)潛水艇在此發(fā)現(xiàn)了眾多活躍的熱液噴口, 它們與在洋中脊的熱液在生物群落、化學(xué)成分、溫度、礦石成分等方面都有明顯的差異[12]。以往的研究多集中在洋中脊熱液區(qū), 對(duì)弧后盆地?zé)嵋簠^(qū)的微生物生態(tài)系研究還很少[13-14]。本文采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)技術(shù), 對(duì)勞盆地深海熱液噴口一個(gè)沉積物站位中的細(xì)菌和古菌分布進(jìn)行了初步研究, 旨在了解該區(qū)域微生物生態(tài)系的組成及多樣性, 為揭示微生物在海洋沉積物和洋殼中的生物地球化學(xué)作用[15-16]奠定基礎(chǔ), 進(jìn)而促進(jìn)深海熱液生物資源的研究和利用。

1 材料與方法

1.1 材料

本文研究的樣品來(lái)自“大洋一號(hào)”科考船2007年5月在勞盆地東勞擴(kuò)張中心熱液區(qū)的DY-19-4 TVG9站(176.6018°W, 22.1813°S), 由電視抓斗采樣器采集。樣品為鐵紅色沉積物。采用無(wú)菌方式進(jìn)行二次取樣后立即保存于-20℃, 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存于-80℃。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取、純化

DNA提取采用Wang[17]等的方法。粗提DNA產(chǎn)物用QIAquik PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化, 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增和純化

采用細(xì)菌 16S rRNA 基因通用引物(27F：5′—AGAGTT TGA TCM TGG CTC AG—3′; 1492R：5′—GGT TAC CTT GTT ACG ACT T—3′; M為A或C)[18]和古菌16S rRNA基因通用引物(21F：5′—TTC CGG TTG ATC CYG CCG CCG GA —3′; 958R：5′—YCC GGC GTT GAM TCC AAT T —3′; Y 為 C 或 T, M 同上)[19]進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在 PTC-221熱循環(huán)儀(BIO-RAD)上進(jìn)行。細(xì)菌 PCR 擴(kuò)增條件： 95℃3 min; 94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 33 個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。古菌PCR擴(kuò)增條件： 95℃ 3 min;94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 每個(gè)循環(huán)降低0.2℃, 72℃1.5 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。UNIQ-10柱式膠回收試劑盒(上海生工)純化PCR產(chǎn)物。

1.2.3 克隆文庫(kù)構(gòu)建和RFLP 分析

將回收的 PCR 產(chǎn)物克隆到 PMD-18T載體(TaKaRa)上, 轉(zhuǎn)化到E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂布接種于含有X-gal和氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)16 h左右, 藍(lán)白斑篩選法挑取陽(yáng)性克隆子,進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增。所得產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ/HpaⅡ(Fermentas)37℃過(guò)夜酶切, 經(jīng) 3%凝膠電泳得到RFLP酶切圖譜。

1.2.4 測(cè)序與系統(tǒng)發(fā)育分析

挑選不同帶型的克隆子測(cè)序(上海英俊生物技術(shù)有限公司), 將所得序列提交到 RDP Ⅱ(ribosomal database project)數(shù)據(jù)庫(kù), 利用在線工具 CHIMERA CHECK進(jìn)行序列有效性驗(yàn)證; 通過(guò) BLASTN程序(www.Ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索相似性序列,采用 Clustal X(version 1.8)對(duì)比分析序列, 利用MEGA(version 4)軟件中的 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

從5 g沉積物樣品中抽提的環(huán)境基因組DNA片段大小集中在23 kb左右, 純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一, 細(xì)菌和古菌的片段大小分別為1 500 bp和900 bp,表明擴(kuò)增效果較好。

2.2 克隆文庫(kù)的構(gòu)建和RFLP分析

自克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑選 88個(gè)細(xì)菌克隆子和96個(gè)古菌克隆子, 限制性?xún)?nèi)切酶酶切后進(jìn)行 RFLP分析。根據(jù)酶切圖譜和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建結(jié)果, 細(xì)菌克隆文庫(kù)可歸屬于50個(gè)OUTs(Operational Taxonomic Units), 3個(gè)優(yōu)勢(shì) OUTs分別占總細(xì)菌文庫(kù)的 18.0%,14.0%, 12.0%, 其余相對(duì)豐度較低, 僅含有1～3個(gè)克隆子。古菌可歸屬于16個(gè)OUTs, 其中4個(gè)優(yōu)勢(shì)OUTs分別為66.7%, 7.3%, 5.2%和4.2%, 其余12個(gè)OUTs的相對(duì)豐度較低, 僅含有1～2個(gè)克隆子。

2.3 細(xì)菌16S rRNA基因文庫(kù)多樣性分析

細(xì)菌文庫(kù)可劃分出 3個(gè)類(lèi)群(圖 1), 變形桿菌(Proteobacteria)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(88.6%), 該門(mén)又可分為Alphaproteobactria, Gamaproteobactria, Deltaproteobactria三個(gè)亞群, 分別占細(xì)菌文庫(kù)總量的 57.3%,27.4%和3.9%。其他類(lèi)群含量相對(duì)較少： 8.0%歸屬于硝化螺旋菌(Nitrospira), 3.4%歸屬于疣微菌(Verrucomicrobia)。變形桿菌類(lèi)群在海洋沉積物中分布廣泛, 往往是熱液流和海水相互作用環(huán)境中優(yōu)勢(shì)種群[20],但其比例和優(yōu)勢(shì)亞群有所差異。如在Rainbow熱液區(qū)沉積物中Gamaproteobactria是最為優(yōu)勢(shì)的類(lèi)群, 大約一半屬于該變形菌門(mén)[21]。在勞盆地沉積物檢測(cè)中發(fā)現(xiàn), 基因型TVG9B-122(9個(gè)克隆子)和 TVG9B-97(7個(gè)克隆子)與地殼熱流中的序列有很高的相似性(97%～98%), 其余基因型與來(lái)自西太平洋暖池等其他海洋環(huán)境沉積物中序列有 91%～99%相似性。

2.4 古菌16S rRNA基因文庫(kù)多樣性分析

泉古菌(Crenarchaeota)和廣古菌(Euryarchaeota)分別占古菌總量的 70.8%和 29.2%, 序列與深海環(huán)境相關(guān)序列有較高的同源性。泉古菌包含MGⅠ(Marine Group Ⅰ)和 MCG (Miscellaneous Crenarchaeotal Group) 2個(gè)類(lèi)群(圖2)。其中以MGⅠ為主, 占古菌文庫(kù)的 59.4%, MCG占古菌文庫(kù)的11.4%。結(jié)果表明, 在TVG9站位的古菌類(lèi)群中MGⅠ為優(yōu)勢(shì)菌群, 它的同源序列分別來(lái)自南沖繩海槽熱液流和馬里亞納海槽南部地?zé)崃? 相似性依次為98%, 99%。MGⅠ在海洋中分布廣泛, 在海水和沉積物中都被檢測(cè)到過(guò)。如在對(duì)Juan de fuca熱液口沉積物的研究發(fā)現(xiàn)[22], 所得到的克隆子全部屬于 MGⅠ,認(rèn)為熱液環(huán)境中的氨氧化古菌可能來(lái)自于這個(gè)類(lèi)群,參與氮的循環(huán)。MCG最初在海洋中被發(fā)現(xiàn), 后來(lái)在陸地和海洋沉積物中都被檢測(cè)到[4,23]。該類(lèi)群同源序列分別來(lái)自馬里亞納海槽地?zé)崃?、武爾卡諾島地?zé)峋凸弦连斔购Ｅ璧責(zé)釃娍诔练e物。

圖1 基于16S rRNA基因的TVG9沉積物細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 1 Bacterial phylogenetic tree based on partial 16S rRNA clones from the sediment sample of TVG9

廣古菌以 MBGE(Marine Benthic Group E)(19.6%)為主, 是一種與甲烷代謝有關(guān)的古菌類(lèi)群[24],與勞盆地東擴(kuò)張區(qū)及馬里亞納海槽南部熱液區(qū)得到的克隆子相似性均為 99%。其他類(lèi)群占 9.6%, 本研究中得到克隆子在勞盆地和其他熱液環(huán)境下得到的基因型相似性較高(98%～99%)。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 所構(gòu)建細(xì)菌和古菌文庫(kù)中的克隆子大多與熱液活動(dòng)相關(guān), 說(shuō)明該區(qū)域受熱液活動(dòng)的影響顯著。探究造成勞盆地和其他熱液研究中微生物種群組成差異性的原因, 認(rèn)為可能是由于勞盆地?zé)嵋簠^(qū)獨(dú)特的洋殼化學(xué)組成[25-27]與熱液噴口活動(dòng)的協(xié)同作用下, 逐漸形成了與其相適應(yīng)的微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖2 基于16S rRNA基因的TVG9沉積物古菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Archaeal phylogenetic tree based on partial 16S rRNA clones from the sediment sample of TVG9

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Phylogenetic analysis of microbial diversity of the sediment from Lau basin

GUO Wen-ting, LIU Xiao-xi, WANG Peng
(State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, Shanghai 200092, China)

May,24,2011

Lau Basin; hydrothermal vent; sediment; microbial diversity; polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP)

The bacterial and archaeal diversity of the deep-sea sediment collected at Lau Basin TVG9 sites were analyzed using a polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis of 16S rRNA gene sequences. The 16S rRNA gene libraries were constructed. The results showed that there were three phyla in the Bacteria domain, including Proteobacteria, Nitrospira, Verrucomicrobia, and the phylum Proteobacteria is predominant, which has three sub-groups including Alphaproteobactria, Gamaproteobactria and Deltaproteobactria. In the Archaea domain, Crenarchaeota dominates over Euryarchaeota. There were two divisions in the Crenarchaeota kingdom, MGⅠ(Marine Group Ⅰ)and MCG(Miscellaneous Crenarchaeotal Group). The MBGE(Marine Benthic Group E) is the dominant group in the Euryarchaeota. This study has uncovered the microbial diversity in the deep-sea hydrothermal region, and provided more evidence for the ecology environmental research.

Q938

A

1000-3096(2012)07-0023-05

2011-05-24;

2012-04-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(91028005)

郭文婷(1977-), 女, 遼寧盤(pán)錦人, 講師, 在讀博士研究生,主要從事海洋地質(zhì)微生物學(xué)研究, E-mail： wenting.g@163.com; 王鵬,通信作者, 電話： 021-65982012, E-mail： pengwang@#edu.cn

(本文編輯：劉珊珊)