酶法提取黃酒糟蛋白工藝研究

左楠楠，王曉偉，金海如

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004）

黃酒糟是黃酒釀造工業(yè)的主要副產(chǎn)物，是發(fā)酵酒醪經(jīng)壓榨、分離去酒液后留下的固形物，一般出糟率為20%～30%，我國(guó)有黃酒生產(chǎn)企業(yè)500多家，因此，黃酒糟的數(shù)量相當(dāng)可觀[1-2]。黃酒糟的熱能比較低，含有不溶性物質(zhì)多，難以直接利用，一般酒廠只對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的粗加工后作為普通的飼料低價(jià)出售，或作為發(fā)酵飼料甚至任其白白爛掉，利用率很低[3]，造成其中蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。

近年來(lái)，隨著世界人口增長(zhǎng)和環(huán)境惡化的加劇，蛋白資源的缺乏已經(jīng)成為人類共同面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題。對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)資源，特別是對(duì)我國(guó)大量低值蛋白資源的精深加工，是解決長(zhǎng)期以來(lái)嚴(yán)重制約我國(guó)食品工業(yè)發(fā)展問(wèn)題的必要途徑[4-5]。植物蛋白具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人們賴以生存的一類數(shù)量龐大的蛋白質(zhì)資源[6]。蛋白質(zhì)通過(guò)控制酶解技術(shù)可獲得一系列高附加值產(chǎn)品，蛋白酶能將蛋白質(zhì)水解為肽和氨基酸，可以提高和改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性、黏度、風(fēng)味等，避免酸堿水解對(duì)氨基酸的破壞作用，保證蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不受影響[7]。植物蛋白經(jīng)水解后，分子量降低，結(jié)構(gòu)疏松，便于人體酶的作用，吸收率大大提高[8]。目前，已有很多研究證明，水解蛋白具有很好的抗氧化性[9-11]。黃酒糟蛋白質(zhì)含量豐富、質(zhì)量較高，脂肪含量低且多為不飽和脂肪酸，可將其用于生產(chǎn)調(diào)味品、提取植物性蛋白和開(kāi)發(fā)低脂高蛋白高纖維保健食品[12]。

本試驗(yàn)研究黃酒糟蛋白的酶法提取工藝，旨在充分開(kāi)發(fā)利用其中主要的水不溶性谷蛋白，可以極大地緩解我國(guó)蛋白資源匱乏的現(xiàn)狀，并可有效發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)，實(shí)現(xiàn)食品工業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

黃酒糟由浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院微生物資源發(fā)掘與利用實(shí)驗(yàn)室自制，粗蛋白含量26.73%（干基），粉碎后過(guò)0.149 mm篩待用；堿性蛋白酶由丹麥諾維信公司提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

試驗(yàn)所用主要儀器與設(shè)備：LDHG-9053BS電熱鼓風(fēng)干燥箱，離心機(jī)，F(xiàn)A1004萬(wàn)分之一電子天平，SHA-2數(shù)顯恒溫振蕩器，PB-10型pH計(jì)，KDN-A凱氏定氮儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝條件 黃酒糟（3.00 g）→加水→調(diào)制適當(dāng)pH值和溫度→酶解→滅酶（100℃，10 min）→離心（5 000 r/min，10 min）→收集上清液→測(cè)定其中氮含量。

1.3.2 總氮含量測(cè)定 總氮含量測(cè)定采用凱氏定氮法。

1.3.3 蛋白質(zhì)提取率計(jì)算[13]水解蛋白提取率=水解液中蛋白質(zhì)量/原料中蛋白質(zhì)量×100%。

1.3.4 堿性蛋白酶提取的單因素試驗(yàn) 以加酶量、pH值、溫度、時(shí)間及料液比作為單因素，研究各單因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.5 堿性蛋白酶提取的正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)，對(duì)加酶量、溫度、pH值、料液比4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平的L9（34）正交試驗(yàn)，以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)優(yōu)化蛋白酶酶解的工藝。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解反應(yīng)各單因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.1 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

從圖1可以看出，蛋白提取率隨加酶量的增加而增大，加酶量從0.5%增至1.5%時(shí)，蛋白提取率增長(zhǎng)迅速；加酶量大于1.5%時(shí)，蛋白提取率增長(zhǎng)緩慢。說(shuō)明加酶量的增大提高了酶對(duì)酒糟中蛋白的作用能力，但當(dāng)全部底物均與蛋白酶結(jié)合時(shí)再繼續(xù)增加酶量，單位時(shí)間內(nèi)一部分酶不再與底物結(jié)合，酶解程度緩慢[14]，提取率就不再提高。

2.1.2 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知，在50～60℃時(shí)，酶的活性較低，蛋白質(zhì)提取率增長(zhǎng)較慢；高于60℃時(shí)，蛋白質(zhì)提取率增長(zhǎng)迅速；但高于65℃，由于酶變性，提取率反而下降。

2.1.3 pH值對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知，pH值小于8.5時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨pH值的增大而上升；pH值在8.0～9.0的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率較高，在此范圍內(nèi)，堿性蛋白酶的活性較高，低于或高于此范圍，酶活力都會(huì)有所下降。pH值為8.5時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值，這可能是由于該蛋白酶的最適反應(yīng)pH值為8.5左右。

2.1.4 固液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

從圖4可以看出，在固液比低于1∶10時(shí)，隨著加液量的增加，蛋白提取率有較大的提高；在固液比為1∶10時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值，此后繼續(xù)加液，蛋白質(zhì)提取率有所下降。原因是料液比過(guò)低時(shí)，反應(yīng)體系較黏稠，難以攪拌混合，體系分散不均勻，酒糟不能很好地與蛋白酶結(jié)合，反應(yīng)不能充分進(jìn)行[15]；料液比過(guò)高時(shí)則降低了酶的相對(duì)濃度[16]，使其與底物碰撞的幾率大大降低，提取率有所下降。

2.1.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 從圖5可以看出，在反應(yīng)的前240 min，蛋白質(zhì)的提取率隨著反應(yīng)的進(jìn)行而增大；適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間，蛋白質(zhì)分子充分溶脹，有利于蛋白質(zhì)的溶出[17]；在240 min之后，蛋白提取率增長(zhǎng)緩慢。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，越來(lái)越多的蛋白質(zhì)分解成氨基酸、多肽類物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)有一定的抑制作用。因此，正交試驗(yàn)中反應(yīng)時(shí)間定為240 min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果（圖6和表2，3）表明，在所選試驗(yàn)因素?cái)?shù)值范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)提取率最高可達(dá)70.81%，其中，加酶量、溫度、料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響均達(dá)顯著水平（P≤0.05）。

由單因素及正交試驗(yàn)（表2）結(jié)果可得出，表觀最佳的因素水平組合為加酶量1.5%，pH值8.0，溫度65℃，料液比1∶10，該組合的蛋白提取率為70.81%。由極差分析得出的最佳因素水平組合為加酶量2.0%，溫度65℃，pH值8.5，固液比1∶10，在此條件下蛋白質(zhì)的提取率為72.25%。因此，以極差分析所得組合作為優(yōu)化水平設(shè)計(jì)，即堿性蛋白酶提取黃酒糟蛋白的優(yōu)化工藝條件為加酶量2.0%，溫度65℃，pH值8.5，固液比1∶10，水解時(shí)間240 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，堿性蛋白酶提取黃酒糟蛋白的最佳因素水平組合為加酶量2.0%，溫度65 ℃，pH 8.5，固液比 1∶10，水解時(shí)間 240 min，在此條件下蛋白質(zhì)的提取率為72.25%。

[1]趙軍，劉月華.白酒糟和黃酒糟的開(kāi)發(fā)利用[J].釀酒，2005，32（5）：73-74.

[2]楊國(guó)軍.中國(guó)黃酒業(yè)調(diào)研報(bào)告[J].中國(guó)釀造，2005（4）：1-5.

[3]夏邦旗.酒糟的綜合利用 [J].陜西糧油科技，1994，19（1）：48-50.

[4]吳元濤，孫恢禮.海洋貝類蛋白資源酶解利用[J].中國(guó)生物工程雜志，2007，27（9）：120-125.

[5]趙謀明，任嬌艷.大宗低值蛋白資源精深加工及高值化利用[J].北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，28（5）：1-5.

[6]張延坤，劉炳智.植物蛋白水解物苦味的產(chǎn)生及其去除方法[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997，12（3）：39-42.

[7]段鋼，趙振鋒，錢瑩.酶制劑在蛋白質(zhì)加工行業(yè)的應(yīng)用[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（4）：104-110.

[8]李志軍，魯寧華，張明.水解蛋白的研究和應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2003（10）：36-38.

[9]張霜玉，王瑛瑤，陳光，等.水酶法從油菜籽中提取油及水解蛋白的研究[J].中國(guó)油脂，2009，34（1）：30-33.

[10]周雪松.水解蛋白來(lái)源的抗氧化肽研究進(jìn)展 [J].中國(guó)食品添加劑，2005，12（6）：84-86.

[11]盧陽(yáng)，王風(fēng)翼，孔繁東，等.大豆蛋白酶水解物抗氧化性的研究[J].大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，20（4）：257-259.

[12]李華，施佳慧.黃酒糟的氨基酸組成及酯類成分分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（34）：17142-17143.

[13]胡睿娟，郝利平.分步酶解法提取扁桃仁油及水解蛋白研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（2）：156-160．

[14]池愛(ài)平，陳錦屏，張海生，等.脫脂米糠酶法水解制備米糠營(yíng)養(yǎng)素工藝研究[J].食品科學(xué)，2006，27（12）：156-160.

[15]王曉雅，朱新鵬，樊海濤，等.堿性蛋白酶提取米糠蛋白的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（6）：38-41.

[16]歐克勤，林立，王亞琴，等.不同蛋白酶處理對(duì)米糠蛋白溶解性的影響[J].食品科技，2009，34（2）：78-82．

[17]王岸娜，孫玉丹，李龍安，等.響應(yīng)面法優(yōu)化獼猴桃糖蛋白提取工藝研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，41（8）：121-127.