一氧化氮在四磨湯誘導(dǎo)大鼠胃竇平滑肌收縮中的作用*

戴遲兵 劉 娜 錢 偉 侯曉華

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科（430022）

四磨湯屬中醫(yī)理氣劑，主要成分為木香、枳殼、檳榔、烏藥，功能破滯降逆，補氣扶正，主治七情氣逆，上氣喘急，妨悶不食。臨床實踐顯示該制劑具有良好的全胃腸促動力效應(yīng)，但關(guān)于其促動力機制的研究目前尚未完善。本課題組的前期研究顯示四磨湯主要通過膽堿能毒蕈堿性受體（M受體）[1]以及部分通過煙堿性受體（N受體）[2]促進胃竇平滑肌收縮。然而，作為一種含有多種組分的中藥方劑，四磨湯促胃腸動力的作用機制較為復(fù)雜，其對胃竇平滑肌收縮活動的興奮效應(yīng)可能尚有其他機制參與。有研究[3]發(fā)現(xiàn)四磨湯的主要組分檳榔提取物能顯著抑制誘生型一氧化氮合酶（iNOS）。鑒于一氧化氮（NO）在胃腸神經(jīng)介導(dǎo)胃腸平滑肌松弛中起重要中介作用，推測NO可能亦參與了四磨湯對胃竇平滑肌收縮的調(diào)節(jié)。本研究以NO供體左旋精氨酸（L-Arg）預(yù)處理大鼠離體胃竇平滑肌條，探討NO在四磨湯誘導(dǎo)胃竇平滑肌收縮中的作用。

材料與方法

一、實驗動物、主要試劑和儀器

雄性Sprague-Dawley大鼠8只，體質(zhì)量300～350 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部提供。

四磨湯口服液（生產(chǎn)批號091245-010，國藥準(zhǔn)字Z20025044，湖南漢森制藥股份有限公司）；L-Arg（Sigma-Aldrich Co.LLC.）；Krebs 液：NaCl 119 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,NaH2PO41.2 mmol/L,MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L,NaHCO325 mmol/L,CaCl22.5 mmol/L,C6H12OH611 mmol/L。

25 mL Myobath 4通道組織浴槽、Haake DC10-P5/U恒溫水浴箱、FORT1010 g力傳感器、SYSTBM4M Transbridge 換能放大器（WPI Inc.）；MP100數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)和AcqKnowledge 3.7.1軟件（BIOPAC Systems,Inc.）。

二、實驗方法

1.大鼠胃竇平滑肌條的獲取和處理：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，禁食不禁水24 h，脫頸椎處死后迅速取出鼠胃，沿大彎剪開，以4℃Krebs液漂洗干凈，置于硅膠平皿中，大頭針固定，分離胃竇，小心去除胃黏膜，以自制雙刀（間距2 mm）切取胃竇縱肌條和環(huán)肌條（8 mm×2 mm），肌條兩端以5-0號絲線結(jié)扎。

將肌條懸掛于盛有25 mL Krebs液的組織浴槽中，37℃恒溫持續(xù)通入含5%CO2、95%O2的混合氣體；給予1.0 g前負(fù)荷，每20 min更換一次Krebs液，平衡1 h，待肌條收縮活動平衡后開始實驗。

2.實驗流程：①記錄基礎(chǔ)狀態(tài)（給藥前）肌條收縮活動5 min，然后依次由低至高累積量加入四磨湯 1、5、25、50、100、150、200 μL，每次加入后記錄肌條收縮活動5 min；②以Krebs液洗滌肌條3次，待收縮活動平衡后記錄基礎(chǔ)狀態(tài)（給藥前）肌條收縮活動 5 min，加入 L-Arg（終濃度 10-4mol/L）后記錄肌條收縮活動5 min，然后依次由低至高累積量加入四磨湯（劑量梯度同步驟①），每次加入后記錄肌條收縮活動5 min。

3.數(shù)據(jù)處理：通過AcqKnowledge 3.7.1軟件獲得不同狀態(tài)下的5 min肌條收縮曲線下面積（AUC），給藥后肌條收縮活性的變化以AUC變化率表示。AUC變化率=（效應(yīng)值－對照值）/對照值×100%，其中對照值為基礎(chǔ)狀態(tài)5 min肌條收縮AUC，效應(yīng)值為給藥后（加入L-Arg、四磨湯或 LArg+四磨湯后）5 min肌條收縮AUC。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、L-Arg預(yù)處理對四磨湯誘導(dǎo)胃竇縱肌收縮的影響

單用四磨湯能劑量依賴性地促進胃竇縱肌條收縮（F=80.62,P=0.000）。加入 10-4mol/L L-Arg 后，縱肌條收縮活性與基礎(chǔ)狀態(tài)相比無明顯變化；繼續(xù)加入梯度劑量四磨湯，縱肌條收縮活性雖然仍呈劑量依賴性增強（F=66.363,P=0.000），但量效曲線較單用四磨湯顯著下移（見圖1），表明NO可部分阻斷四磨湯對胃竇縱肌的興奮效應(yīng)。其中加入LArg+1 μL四磨湯后的縱肌條收縮活性較基礎(chǔ)值增加3.43%±0.78%，與單用等劑量四磨湯（增幅6.24%±0.64%）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；四磨湯劑量增至5～200 μL，加入L-Arg+四磨湯后的縱肌條收縮活性增幅均顯著低于單用等劑量四磨湯，LArg+200 μL四磨湯的縱肌條收縮活性增幅為組內(nèi)最高，但仍顯著低于單用等劑量四磨湯（48.02%±3.38%對 128.84%±7.47%,P<0.05）。

二、L-Arg預(yù)處理對四磨湯誘導(dǎo)胃竇環(huán)肌收縮的影響

單用四磨湯能劑量依賴性地促進胃竇環(huán)肌條收縮（F=94.01,P=0.000）。加入 10-4mol/L L-Arg 后，環(huán)肌條收縮活性與基礎(chǔ)狀態(tài)相比無明顯變化；繼續(xù)加入梯度劑量四磨湯，環(huán)肌條收縮活性雖然仍呈劑量依賴性增強（F=73.375,P=0.000），但量效曲線較單用四磨湯顯著下移（見圖2），表明NO可部分阻斷四磨湯對胃竇環(huán)肌的興奮效應(yīng)。其中加入LArg+1 μL四磨湯后的環(huán)肌條收縮活性增幅即已顯著低于單用等劑量四磨湯（－2.53%±0.31%對4.56%±0.84%,P<0.05）；L-Arg+150 μL 四磨湯的環(huán)肌條收縮活性增幅為組內(nèi)最高，但仍顯著低于單用等劑量四磨湯（39.40%±2.73%對 141.47%±9.05%,P<0.05）。

三、L-Arg預(yù)處理后四磨湯誘導(dǎo)的胃竇縱肌、環(huán)肌收縮活動的差異

經(jīng)L-Arg預(yù)處理的胃竇平滑肌條，加入低中劑量（1～50 μL）四磨湯后，縱肌條收縮活性增幅顯著高于環(huán)肌條（1 μL:3.43%±0.78%對－2.53%±0.31%,5 μL:6.02%±0.90%對 1.80%±0.59%,25 μL:14.38%±1.13%對 9.34%±1.01%,50 μL:25.58%±2.16%對 17.66%±1.37%,P均<0.05）；加入高劑量（100～200 μL）四磨湯后，縱肌條與環(huán)肌條收縮活性增幅無明顯差異（見圖3）。單用1～200 μL四磨湯，對縱肌條與環(huán)肌條收縮活性的影響無明顯差異。

討 論

NO是腸神經(jīng)系統(tǒng)中重要的非腎上腺素能非膽堿能抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可由其前體L-Arg在NOS的作用下轉(zhuǎn)化生成，對胃腸運動具有負(fù)向調(diào)控作用。本課題組的前期研究[1,2]顯示四磨湯主要通過興奮膽堿能受體對胃竇平滑肌產(chǎn)生促收縮作用。有研究發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)源性NO可增強電場刺激（electrical field stimulation,EFS）誘導(dǎo)的膽堿能反應(yīng)[4]，并使平滑肌對EFS顯現(xiàn)出非膽堿能興奮效應(yīng)[5]。鑒于四磨湯的主要組分檳榔提取物能顯著抑制iNOS[3]，本研究對四磨湯是否還可通過抑制NO釋放調(diào)節(jié)胃竇平滑肌收縮進行了探討。

作為NO的前體，L-Arg對靜息狀態(tài)的胃竇平滑肌收縮并無調(diào)節(jié)作用[6]，本研究結(jié)果與之相符。通過本研究數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，以L-Arg預(yù)處理大鼠胃竇平滑肌條，外源性NO對經(jīng)四磨湯作用后處于興奮狀態(tài)的平滑肌條產(chǎn)生了明顯的抑制效應(yīng)，但尚不能完全阻斷平滑肌條收縮活性增強的趨勢，表明抑制NO釋放可能是四磨湯促進胃竇平滑肌收縮的機制之一，但并非主要機制。后續(xù)研究擬檢測四磨湯作用后胃竇平滑肌NO含量的變化，以進一步明確該作用機制。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在外源性NO的作用下，四磨湯對胃竇縱肌條與環(huán)肌條的促收縮作用存在差異。經(jīng)L-Arg+低中劑量四磨湯作用的環(huán)肌條，收縮活性增幅顯著低于縱肌條，而單用四磨湯對縱、環(huán)肌條收縮活性的影響無明顯差異，提示NO在縱、環(huán)肌中的作用程度不同，四磨湯對環(huán)肌的興奮效應(yīng)較縱肌更多依賴于對NO釋放的抑制。已知煙堿可刺激人乙狀結(jié)腸神經(jīng)釋放NO。McKirdy等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，乙狀結(jié)腸環(huán)肌條對EFS的收縮反應(yīng)峰值時間（time to peak,TTP）顯著長于縱肌條，而NOS抑制劑硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）可顯著縮短環(huán)肌條的TTP，使之對EFS的收縮反應(yīng)模式與縱肌條趨于一致；煙堿可顯著抑制由EFS誘導(dǎo)的環(huán)肌條收縮，對縱肌條收縮則無明顯影響，而L-NAME可阻斷煙堿對環(huán)肌條收縮的抑制作用。上述結(jié)果提示神經(jīng)刺激引起的NO釋放在環(huán)肌中更為明顯，與本研究發(fā)現(xiàn)相符。目前雖無直接證據(jù)表明NO對胃竇縱、環(huán)肌具有不同影響，但關(guān)于NO合成相關(guān)酶類分布的研究發(fā)現(xiàn)，參與從L-瓜氨酸再合成NO前體L-Arg的精氨酸琥珀酸合成酶和裂解酶分布于犬類全消化道環(huán)肌神經(jīng)束，但僅分布于回結(jié)腸縱肌[8]；直接參與NO合成的NOS主要分布于鴿全消化道肌間、環(huán)肌和黏膜下神經(jīng)叢[9]。這些發(fā)現(xiàn)為本研究推論，即四磨湯對大鼠胃竇環(huán)肌的促收縮作用較縱肌更多依賴于抑制NO釋放提供了理論上的支持。

綜上所述，四磨湯對大鼠胃竇平滑肌具有明顯促收縮作用，該作用部分是通過抑制NO釋放實現(xiàn)的；四磨湯對胃竇環(huán)肌的興奮效應(yīng)較縱肌更多依賴于抑制NO釋放。關(guān)于四磨湯調(diào)節(jié)胃竇平滑肌收縮的其他機制，尚待進一步研究。

1 戴遲兵，劉娜，陳文妹，等.四磨湯對大鼠胃竇平滑肌影響及其機制的研究[J].胃腸病學(xué),2011,16(10):605-608.

2 錢偉，戴遲兵，陳文妹，等.N受體在四磨湯對胃竇平滑肌影響中的作用[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2011,20(11):1029-1032.

3 Bhandare A,KshirsagarA,Vyawahare N,etal.Evaluation of anti-migraine potential of Areca catechu to prevent nitroglycerin-induced delayed inflammation in rat meninges:possible involvement of NOS inhibition.J Ethnopharmacol,2011,136(1):267-270.

4 Garella R,Baccari MC.Contribution of endogenous nitrergic and peptidergic influences to the altered neurally-induced gastric contractile responses in strips from dystrophic(mdx)mice[J].Regul Pept,2010,160(1-3):57-63.

5 Shuttleworth CW,Sanders KM,Keef KD.Inhibition of nitric oxide synthesis reveals non-cholinergic excitatory neurotransmission in the canine proximal colon[J].Br J Pharmacol,1993,109(3):739-747.

6 Okuno Y,Kondo T,Saeki A,et al.Colon-specific contractile responses to tetrodotoxin in the isolated mouse gastrointestinal tract[J].Auton Autacoid Pharmacol,2011,31(1-2):21-30.

7 McKirdy HC,Richardson CE,Green JT,etal.Differential effect of nitric oxide synthase inhibition on sigmoid colon longitudinal and circular muscle responses to nicotine and nerve stimulation in vitro[J].Br J Surg,2004,91(2):229-234.

8 Daniel EE, Wang YF, Salapatek AM, et al.Arginosuccinate synthetase,arginosuccinate lyase and NOS in canine gastrointestinal tract:immunocytochemical studies[J].Neurogastroenterol Motil,2000,12(4):317-334.

9 Mirabella N,Lamanna C,AssisiL,etal.The relationships of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-d to nitric oxide synthase,vasoactive intestinal polypeptide,galanin and pituitary adenylate activating polypeptide in pigeon gut neurons[J].Neurosci Lett,2000,293(2):147-151.