用釀酒酵母測(cè)定直接耐曬寶石藍(lán)的急性毒性

譚之楊，張尚勇

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用釀酒酵母測(cè)定直接耐曬寶石藍(lán)的急性毒性

譚之楊，張尚勇*

（武漢紡織大學(xué) 紡織科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430073）

本文的目的是建立直接耐曬寶石藍(lán)的急性毒性微量快速分析方法。通過(guò)用基于電阻法細(xì)胞計(jì)數(shù)原理的手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定由密度約為1.0×104細(xì)胞/ml的釀酒酵母懸液20 μl和系列濃度待測(cè)染料溶液130 μl與2.2倍YPD液體培養(yǎng)基110 μl所組成的體系在30℃、150 r/min恒溫?fù)u床上震蕩培養(yǎng)6 h后的細(xì)胞數(shù)目，求算出該染料的EC50。結(jié)果顯示直接耐曬寶石藍(lán)對(duì)釀酒酵母的EC50為4995 mg/l，與文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠經(jīng)口LC50=5 g/kg一致。表明本法可作為傳統(tǒng)急性毒性測(cè)定的替代方法。

釀酒酵母；直接耐曬寶石藍(lán)；急性毒性

直接染料對(duì)纖維有較強(qiáng)的親和力，無(wú)須媒染劑就可以上染纖維素纖維，直接染料生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單，使用方便，價(jià)格低廉，廣泛應(yīng)用于棉纖維染色，也可用于粘膠、真絲等纖維的染色以及制革、造紙等工業(yè)產(chǎn)品的染色。

多數(shù)直接染料的原料為芳香胺，芳香胺是一類致癌物質(zhì)。因此，在德國(guó)首批禁用染料中，直接染料占了很大的比重，其中以聯(lián)苯胺、二甲基聯(lián)苯胺等三類衍生物作為中間體合成的直接染料占全部被禁用的直接染料的90%以上。

目前的直接染料檢測(cè)方法中規(guī)定使用的主要儀器是氣質(zhì)聯(lián)用儀，目前全部依靠進(jìn)口，每臺(tái)氣質(zhì)聯(lián)用儀折合人民幣在80萬(wàn)元左右，每臺(tái)設(shè)備一天最多只能檢驗(yàn)30份樣品，同時(shí)在檢測(cè)處理過(guò)程中要使用大量高純度試劑和進(jìn)口提取柱等材料，費(fèi)用相當(dāng)高。多數(shù)地市級(jí)檢測(cè)機(jī)構(gòu)都沒(méi)有能力購(gòu)置配備這一檢測(cè)設(shè)備，也就無(wú)法開(kāi)展相應(yīng)的檢驗(yàn)工作，這制約了我國(guó)直接染料檢測(cè)的覆蓋范圍。

而傳統(tǒng)的急性毒性測(cè)試一般需要設(shè)置5-7個(gè)劑量組，同時(shí)規(guī)定每個(gè)劑量組的小鼠、裸鼠或豚鼠的數(shù)目不少于10只；大鼠、新西蘭兔的數(shù)目為6-8只；家兔、犬等的數(shù)目為4-6只，根據(jù)24 h的死亡率和14天內(nèi)的總死亡數(shù)計(jì)算速死性化合物求其LD50(LC50)，并需要詳細(xì)觀察動(dòng)物中毒癥狀的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，死前癥狀、死亡時(shí)間、體重變化、出汗流涎，血性分泌物、瞳孔改變、器官有無(wú)充血、出血、水腫或其它改變。

傳統(tǒng)急性毒性測(cè)定過(guò)程的復(fù)雜性、高成本、高耗時(shí)以及殘留的動(dòng)物尸體對(duì)環(huán)境的二次污染等問(wèn)題迫使人們嘗試開(kāi)發(fā)魚(yú)類毒性測(cè)試、蚤類毒性測(cè)試、四膜蟲(chóng)毒性測(cè)試、藻類毒性測(cè)試、發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試和生物傳感器測(cè)試方法：

魚(yú)類毒性測(cè)試方法：魚(yú)類毒性實(shí)驗(yàn)采用24 h、48 h、96 h測(cè)定有毒物質(zhì)的LC50，適用于水中單一物質(zhì)的毒性測(cè)定，但靜水法、換水法和流水法測(cè)定結(jié)果不一致，同時(shí)需要大量實(shí)驗(yàn)材料和多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)[1]。

蚤類毒性測(cè)試方法：蚤類是國(guó)際上普遍采用的實(shí)驗(yàn)生物[2，3]。采用死亡率、捕食行為改變?yōu)橹笜?biāo)。但標(biāo)準(zhǔn)不易統(tǒng)一。

四膜蟲(chóng)毒性測(cè)試方法：采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)和流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測(cè)四膜蟲(chóng)()的彗尾長(zhǎng)度、拖尾率、細(xì)胞損傷率、DNA損傷以及DNA相對(duì)熒光強(qiáng)度，從DNA損傷角度探討工業(yè)廢水中常見(jiàn)的含氮雜環(huán)化合物對(duì)四膜蟲(chóng)的毒性作用[4]。但該法所測(cè)試的毒性種類有限，很難用于染料及其印染廢水毒性測(cè)試。

藻類毒性測(cè)試方法：斜生柵藻、小球藻、鹽澤螺旋藻、扁藻等的生長(zhǎng)抑制為測(cè)試指標(biāo)可測(cè)定被檢測(cè)物的急性毒性，也有將細(xì)菌熒光酶基因轉(zhuǎn)入絲狀體固氮藍(lán)藻-魚(yú)腥藻中，利用其作為報(bào)告基因，通過(guò)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的測(cè)定來(lái)檢測(cè)被測(cè)物的急性毒性[5]。但是工作量大，測(cè)定周期長(zhǎng)，而且不適用于染料。

發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試方法：美國(guó)Backman公司研制了一種商品名為Microtox的生物發(fā)光光度計(jì)(即生物毒性測(cè)定儀)[6]，其中明亮發(fā)光桿菌發(fā)光強(qiáng)度的變化檢測(cè)污染物的毒性的靈敏度與魚(yú)類96 h急性毒性實(shí)驗(yàn)相當(dāng)。我國(guó)于1995年將這一方法列為水質(zhì)急性毒性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法。青海孤菌(sp. nov.)也用于淡水樣品的生物毒性檢測(cè)。硝化細(xì)菌也用于有毒物質(zhì)的毒性檢測(cè)。英國(guó)PPM公司研發(fā)了一種名為AMTOX的在線測(cè)試儀，該儀器基于固定化硝化細(xì)菌消耗樣品中的氨，并通過(guò)測(cè)定底物中氨氮的消耗速率來(lái)檢測(cè)樣品的毒性。但是，發(fā)光細(xì)菌法檢測(cè)毒性具有發(fā)光強(qiáng)度本底值差異較大，檢測(cè)期間發(fā)光變化幅度寬的問(wèn)題，所測(cè)得的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。同時(shí)，由于許多染料本身是熒光淬滅劑，不適于該法。

生物傳感器測(cè)試方法：用于毒性檢測(cè)的生物傳感器有酶?jìng)鞲衅鱗7]、微生物傳感器[8]、DNA傳感器[9]和免疫傳感器[10]等。但是，酶、DNA和抗原-抗體的專一性強(qiáng)，因此，一種生物傳感器只能特異地檢測(cè)一種物質(zhì)的毒性。

目前還沒(méi)有建立適用于評(píng)價(jià)染料及其印染廢水毒性的合適方法。因此，只有少數(shù)染料具有急性毒性LD50數(shù)據(jù)，絕大多數(shù)染料的毒性數(shù)據(jù)還是空白。開(kāi)發(fā)可靠、方便、快捷的生物毒性檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急。本文進(jìn)行了直接耐曬翠藍(lán)GB(又稱錫利翠藍(lán)GL、直接耐曬翠藍(lán)GL、直接耐曬寶石藍(lán)；Lionol Blue GB)的急性毒性測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 制備釀酒酵母菌懸液

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌牙簽收集平板培養(yǎng)釀酒酵母單菌落轉(zhuǎn)入標(biāo)號(hào)為①的已滅菌的Eppendorf管中，加入1000 μl無(wú)菌純水混懸，取該混懸液200 μl加入1支5 ml無(wú)菌試管中，加入1.8 ml無(wú)菌純凈水，在分光光度計(jì)上測(cè)得OD600=0.248，得知①號(hào)管中懸液的細(xì)胞密度為0.248÷1.4×108×10=1.7714×108個(gè)/ml；從①管取56.4 μl入②管，加入944 μl無(wú)菌純凈水即成1×107個(gè)/ml的菌懸液；將②管中的菌懸液稀釋1000倍，即配制成細(xì)胞密度約為1.0×104個(gè)/ml的菌懸液，放入4℃冰箱中備用。

1.2 配制直接耐曬翠藍(lán)GB溶液

用電子天平稱取60 mg直接耐曬翠藍(lán)GB入5 ml連蓋離心管中，加無(wú)菌純水3 ml溶解，放入4℃冰箱中備用(染料儲(chǔ)備液)；將編號(hào)為0#-11#和編號(hào)為0’#-11’#的1.5 ml無(wú)菌Eppendorf管，分兩排放在5×16=80孔多功能彩色離心管架上，用單道可調(diào)20-300 μl量程移液器配合20-300 μl吸頭分別取130 μl濃度為20000 mg/l的待測(cè)直接耐曬翠藍(lán)GB溶液入11#、11’#和10#管；在10#管中加入無(wú)菌純水260 μl，混勻后；從10#管分別取130 μl混合液入10’#和9#管，并加入無(wú)菌純水260 μl，然后混勻，依次配制8#-1#、9’#-1’#管溶液，從1#、1’#管用移液器取出130 μl混合液棄去；得到20000、6667、2222、741、247、82.3、27.4、9.14、3.05、1.02、0.34 mg/l共11種濃度的直接耐曬翠藍(lán)GB待測(cè)溶液共2組。

1.3 培養(yǎng)細(xì)胞

將上述24支Eppendorf管放在冰浴中，0#和0’#管則加入130 μl無(wú)菌純凈水，所有管中均加入2.2倍YPD液體培養(yǎng)基110 μl和20 μl細(xì)胞密度為3.0×105個(gè)/ml的菌懸液；蓋好管蓋，在30℃、150 r/min恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)7.5小時(shí)。

1.4 洗滌細(xì)胞

取出各離心管放入小型高速離心機(jī)中，用4000 r/min離心10 min，棄上清液；用12道可調(diào)20-300 μl量程移液器加入PBS(pH 7.4)緩沖液300 μl洗滌各離心管中的細(xì)胞團(tuán)2次。

1.5 計(jì)數(shù)懸液制備

將各洗滌后的細(xì)胞團(tuán)分別用PBS(pH 7.4)緩沖液配制成240 μl菌懸液。

1.6 測(cè)定細(xì)胞數(shù)目

用電阻法細(xì)胞計(jì)數(shù)原理的手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定菌懸液的細(xì)胞濃度。

1.7 求算染料EC50范圍

將所測(cè)得的各管菌懸液的細(xì)胞濃度減去初始細(xì)胞濃度，除以對(duì)照管菌懸液的細(xì)胞濃度，定義為細(xì)胞分裂率；將相同濃度染料的細(xì)胞分裂率平均，將染料濃度除以2所得數(shù)值為橫坐標(biāo)、平均細(xì)胞分裂率為縱坐標(biāo)繪圖，得到一條曲線，通過(guò)縱坐標(biāo)上的一點(diǎn)(0,50)作X軸的平行線，交曲線于A點(diǎn)，過(guò)A點(diǎn)作Y軸的平行線，交X軸于B點(diǎn)，B點(diǎn)的橫坐標(biāo)數(shù)值即為所求染料的EC50范圍。

1.8 測(cè)定和求算染料EC50

重復(fù)步驟1.2至步驟1.7，但步驟1.2中的梯度稀釋系數(shù)需根據(jù)染料EC50范圍重新確定，分別將a取整，得到L’和H’，以L’和H’為再次測(cè)定過(guò)程中的染料溶液的濃度范圍。B1點(diǎn)的橫坐標(biāo)數(shù)值即為所求染料的EC50-粗略值，將B1上下兩個(gè)濃度值分布記為L(zhǎng)1和H1，將線段L1H1分成10等份，觀察B1對(duì)應(yīng)的小刻度數(shù)值，并記為b；然后根據(jù)公式(H1- L1)÷10×b計(jì)算出EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度直接耐曬翠藍(lán)GB對(duì)釀酒酵母細(xì)胞增殖的影響（見(jiàn)表1）

表1 直接耐曬翠藍(lán)GB對(duì)釀酒酵母細(xì)胞增殖的影響

2.2 染料EC50范圍為3333~10000 mg/l（見(jiàn)圖1）

圖1 直接耐曬翠藍(lán)GB對(duì)釀酒酵母分裂的影響

圖2 EC50范圍直接耐曬翠藍(lán)GB對(duì)釀酒酵母分裂的影響

2.3 染料EC50值為4995 mg/l

即L1=4400，H1=5100，將線段L1H1分成10等份，可見(jiàn)B1對(duì)應(yīng)的小刻度數(shù)值約為b=8.5，EC50=(H1-L1)÷10×b=(5100-4400)÷10×8.5=4995 mg/l，見(jiàn)圖2、圖3。

圖3 直接耐曬翠藍(lán)GB的EC50的求算示意圖(局部放大)

3 討論

計(jì)算出EC50=4995 mg/l。與文獻(xiàn)報(bào)道的小鼠口經(jīng)LC50=5 g/kg一致。

和現(xiàn)有的方法相比，本方法具有如下主要優(yōu)點(diǎn)：

微量：消耗的待測(cè)染料低于60 mg，特別適用于紡織品上染料的急性毒性測(cè)試。

快速：測(cè)定一種物質(zhì)的大致EC50-范圍的時(shí)間不超過(guò)8 h，一人在一天內(nèi)可測(cè)試上百種物質(zhì)；測(cè)定一種物質(zhì)的EC50由一人在一天內(nèi)可完成。

低耗：測(cè)定1種樣品消耗：1只25 ml無(wú)菌試管，折合人民幣0.1元；54只20-300μl 標(biāo)準(zhǔn)吸頭，折合人民幣5.94元；55只1.5 ml連蓋離心管，折合人民幣2.2元；YEPD液體培養(yǎng)基5.5 ml，折合人民幣0.03元；PBS(pH 7.4)緩沖液42.3 ml，折合人民幣0.04元；Scepter傳感器24片，折合人民幣48元；電費(fèi)4.00元；合計(jì)60.3元人民幣。如果同時(shí)測(cè)定幾種物質(zhì)，則測(cè)定費(fèi)用更低。

方便：只需要超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、電阻法手持式細(xì)胞計(jì)數(shù)器即可方便地開(kāi)展工作，全部設(shè)備總價(jià)值最低可達(dá)4萬(wàn)元人民幣以下。

通用：適用于各種在水中有一定溶解度的物質(zhì)的急性毒性測(cè)試。

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Determination of the Acute Toxicity for Direct Fast Turquoise Blue GL by Saccharomyces Cerevisiae Meyen ex Hansen

TAN Zhi-yang, ZHANG Shang-yong

(College of Textile, Wuhan Textile University, Wuhan Hubei 430073, China)

This study was aimed to establish a quick acute toxicity analysis for Direct Fast Turquoise Blue GL (DFTB). Yeast (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex Hansen) cell suspension which density was about 1.0×104cells/ml was preparation. Then a series of concentrations of the dye solution was preparation. The suspension systems were composed of 20 μl of the yeast suspension, 130 μl of the series of concentrations dye solution and 110 μl of 2.2-fold YPD liquid medium. Yeast cells were grown in the suspension system on a shaker with 150 rpm at 30°C. After incubated for 6 h, cell numbers were counted with a hand-held cell counter (Millipore Scepter). EC50was calculated. The results suggest that the EC50of DFTB was 4995 mg/l and the results were satisfactory. Conclusion: This method can be used as an alternative to the traditional LD50to acute toxicity determined in mice.

Saccharomyces Cerevisiae; Direct Fast Turquoise Blue GL; Acute Toxicity

X502

A

1009－5160(2012)03－0056－04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（50978208).

*通訊作者：張尚勇（1967-），男，博士，教授，研究方向：紡織科學(xué)與工程.