一株海水細菌的分離鑒定及其脫硫效果的初步驗證

王李寶，沈 輝，凌 云，黎 慧，萬夕和，鐘 非，張朝暉

（江蘇省海洋水產研究所，江蘇南通 226007）

沉積物是各種海洋污染物的源和匯，隨著海洋污染的加劇，沉積物中的有機質、氮、磷、重金屬、硫化物等的含量逐漸增加，不但危害底棲生物的生存環(huán)境和水產品質量，而且容易造成水體的二次污染，這種情況在海水養(yǎng)殖池塘里表現得尤為突出[1]。因此，去除沉積環(huán)境中的污染物，或對受污染的沉積環(huán)境進行生物修復，是維持海水養(yǎng)殖健康發(fā)展的有效手段。

迄今為止，已報道的自然界中有關氧化硫化物的微生物主要有絲狀硫細菌、光合硫細菌和無色硫細菌[2]，其中脫硫桿菌屬Thiobacillus的8種桿菌能在厭氧條件下，利用硝酸鹽為電子受體同步去除硫化物[3]。由于以上脫硫微生物作為自養(yǎng)菌耐有機負荷的能力相對均較弱，且同步脫氮脫硫理論目前絕大部分是應用在工業(yè)領域。本研究從異養(yǎng)硝化細菌中分離得到一株脫硫細菌NG6-3，并從形態(tài)學、生理生化及分子生物學方面對該菌進行了初步研究，為今后利用該菌株對沉積物環(huán)境中硫化物進行生物降解奠定一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 硫化物氧化細菌的篩選和形態(tài)觀察

1.1.1 沉積物樣品

啟東呂四鎮(zhèn)某海水養(yǎng)殖池塘，多年蝦蟹混養(yǎng)池，離池底液面5～10 cm的暗黑色泥樣。

1.1.2 分離和篩選培養(yǎng)基

1.1.2.1 分離培養(yǎng)基

采用普通的2116E培養(yǎng)基。

1.1.2.2 篩選培養(yǎng)基

（NH4）2SO40.5 g，蔗糖 5.00 g ，牛肉膏 1.00 g，Na2S 飽和液 1.5 mL，1 000 mL 陳海水，pH 7.6～7.8。

1.1.3 分離和篩選步驟

1.1.3.1 異養(yǎng)硝化細菌的分離

按彭光浩等[4]方法，采用稀釋平板法分離得到菌株，并在平板上用格里斯（Griess）試劑直接點滴判定硝化活性，選取硝化活性較強者在分離培養(yǎng)基平板上劃線純化，作為脫硫細菌篩選的供試菌株。得純菌113株。

1.1.3.2 脫硫細菌的篩選

將上述純133株菌株分別接至2116E培養(yǎng)基（不含瓊脂）中，37℃培養(yǎng)24 h，再按2%（v/v）的接種量轉接至篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，適時測定培養(yǎng)基中硫化物含量，以篩選出具有硫化物降解能力的菌株。在113株菌株中篩選得到一株具有較強硫化物降解能力的菌株，編號NG6-3，用于后續(xù)研究。

1.2 細菌初步鑒定

1.2.1 形態(tài)學觀察

將菌株NG6-3在分離培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)，在光學顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、鞭毛形態(tài)及芽孢形態(tài)[5]。

1.2.2 生理生化檢查

取純培養(yǎng)的菌株NG6-3，分別接種于細菌生化特性鑒定用培養(yǎng)基中，按常規(guī)進行氧化酶、接觸酶、糖（醇及苷）類代謝、H2S、吲哚、MR（V-P）試驗、硝酸鹽還原、枸櫞酸鹽利用等，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[5]進行。并結合API－32E細菌鑒定系統(tǒng)的生化反應結果，對NG6-3的種屬進行初步判定[6]。

1.2.3 16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學分析

1.2.3.1 菌株NG6-3基因組DNA的提取

取對數培養(yǎng)期的菌懸液1.5 mL，采用酚－氯仿法提取細菌DNA[7-8]。加100 μL TE溶液溶解。

1.2.3.2 菌株NG6-3部分序列分析

以提取的DNA為模板，采用細菌通用引物（正向27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向1495R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’，)進行 16S rRNA 基因擴增。反應條件：96 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s；52℃退火l min 30 s；72℃延伸l min 30s；30個循環(huán)，延伸10 min。PCR產物經檢測純化后，由上海生物工程技術公司進行基因測序。

對供試菌株NG6-3基因序列通過NCBI（NCBI菌株提交號EU081880.1）的Blast檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，并用MEGA4.1軟件與從Genbank數據庫中獲得的序列相似性較高的菌株的序列進行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用鄰接法（neighbor joining method）獲得分支系統(tǒng)樹，并通過Bootstrap法（1 000次重復）檢驗。

1.2.4 菌種分類位置的確定

根據供試菌株形態(tài)、培養(yǎng)及理化特性測定的結果，主要依據《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology.9thed》[9]、《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》[10]及相關資料，進行種屬分類位置判定。

1.3 安全性試驗

設待測菌株、陽性對照菌和陰性對照實驗組，每組設2個平行，每個平行隨機選取暫養(yǎng)7 d的健康凡納濱對蝦50尾；每尾注射待測菌株、陽性對照菌和陰性對照50 μL，每天記錄其死亡情況。陽性對照為鰻弧菌，陰性對照為不接種處理。每株菌用107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL和104cfu/mL 4個濃度進行肌肉注射。

1.4 脫硫效果的初步驗證

取50 mL以硫化鈉作為惟一硫源的液體培養(yǎng)基于250 mL的錐形瓶中，接種1 mL處于對數生長期的供試菌液，以沒有接種菌液的培養(yǎng)基作為空白對照。調節(jié)初始pH為7.8，在30℃，靜置培養(yǎng)，定期測定菌體生長量及培養(yǎng)基中硫化物質量濃度。硫化物的測定采用碘量法[11]。

2 實驗結果

2.1 菌株NG6-3的鑒定結果

2.1.1 供試菌株的分離和形態(tài)學觀察

從上述泥樣分離純化得到一株具有氨氧化能力和脫硫能力的菌株，命名為NG6-3。菌株NG6-3在2116E培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后形成直徑為1.5 mm、乳白色、邊緣整齊的細小菌落，圓形，表面濕潤，光滑，呈蠟狀（圖1）。在1 000倍光學顯微鏡下觀察，菌株NG6-3革蘭氏陰性，細胞為橢圓形，無芽孢，細胞大小為 0.5～1.0 μm×1.0～2.0 μm（圖 2）。

進一步對菌株NG6-3做磷酸鎢負染，透射電鏡下觀察呈短桿狀，無鞭毛（圖3）。

圖1 NG6-3的菌落形態(tài)Fig.1 The colony of strain NG6-3

圖2 NG6-3的顯微形態(tài)Fig.2 The morphology of strain NG6-3

2.1.2 理化實驗結果

供試菌株NG6-3在法國梅里埃公司API-32E系統(tǒng)生化反應結果見表，相應的軟件進行供試菌株的所屬分析表明與弧菌屬的相似性較高（98%）。其中鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、L-阿拉伯糖醇、酚紅、吲哚產生、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖反應呈陽性，主要的生化反應結果見表1。

2.1.3 16S rRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育學分析

利用細菌通用引物，對菌株的16S rDNA序列進行擴增并測序，得到序列長度為957 bp（GenBank登錄號為EU081880）。將序列在NCBI數據庫中進行BLAST分析，該菌株與弧菌屬中部分菌株（CP001805.1）的相似性為99%，其在系統(tǒng)分類中位置如圖4所示。有關弧菌屬的細菌能夠在海水環(huán)境中同步去除硫化物和銨態(tài)氮的研究在國內外還未見報道。

2.2 菌株NG6-3的安全性試驗結果

圖3 菌株NG6-3的電鏡照片Fig.3 Electronic micrograph of the isolated strain NG6-3

圖4 根據16S rRNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence

表1 菌株NG6－3的API32E生理生化實驗結果Tab．1 Bio－chemical characteristics of strain NG6－3 by API32E test

注射待測菌，生理鹽水和陽性對照后，每天記錄死亡數，計算其累積死亡率，用SPSS17．0軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析，結果見表2。

表2 NG6－3安全性試驗中各組凡納濱對蝦的累積死亡率（%）Tab．2 The cumulative mortality of Litopenaeus vannamei in safety test(%)

NG6－3 的 107cfu/mL、106cfu/mL、105cfu/mL 和 104cfu/mL注射組與生理鹽水注射組在觀察的兩周時間內均無死亡現象；而陽性對照鰻弧菌的107cfu/mL和106cfu/mL注射組均引起對蝦大量死亡，顯著高于其他注射組（P＜0．05）。由此可知，NG6－3 對凡納濱對蝦無毒害作用。

2．3 菌株NG6－3脫硫效果的初步研究

接種有供試菌NG6－3的培養(yǎng)基中硫化物含量第2天就為對照組的44．3%，第5天開始，在培養(yǎng)基中幾乎測不到硫化物的存在，隨著硫化物含量的降低菌株生長量逐漸增大（圖5）。

圖5 菌株NG6－3的硫化物出去除效果Fig．5 The removal effect of sulfide based on strain NG6－3

3 討論

目前報道的具有硫化物氧化能力的微生物有蝕陰溝硫桿菌Thiobacillus concretivorus[12]、酒色著色菌Chromatium vinosum[13]、氧化亞鐵硫桿菌 Thiobacillus ferrooxidans[13]、氧化硫硫桿菌 Thiobacillus thiooxidans[15]、排硫桿菌 Thiobacillus thioparus[16]、鏈霉菌 Streptomyces sp．strainSH91[17]和弓形菌 Arcobacter sp．[18]等?；【诤Ｋ蟹植紡V泛，是海水環(huán)境中的常見細菌，部分弧菌在一定條件下可導致海水養(yǎng)殖對象致病[19]?；【诤Ｋh(huán)境中長期存在，對環(huán)境中的各種營養(yǎng)物質產生了依賴作用，可以利用環(huán)境中的不同物質作為營養(yǎng)而生存。弧菌屬Vibrio的哈氏弧菌Vibrio harveyi、費氏弧菌Vibrio fisher早期曾經均被作為發(fā)光細菌用于在水環(huán)境污染物的檢測，后并被證實多種弧菌均為非致病菌[20]。本研究中分離得到一株既能利用Na2S，又能進行氨氧化作用的細菌，并結合了初步的安全性試驗，排除了其潛在的致病性。對擴大海水養(yǎng)殖環(huán)境改良菌的篩選范圍，提供了一個大膽的思路。

早在上世紀，BISOGNI等[21]利用富集培養(yǎng)的脫氮硫桿菌以硫代硫酸鹽和硫化物為電子供體進行了小試的自養(yǎng)反硝化研究，表明脫氮硫桿菌是典型的能夠同時利用硫化物和硝酸鹽的細菌。同步去除氨氮和硫化物的研究最早集中在制藥廢水、食品發(fā)酵廢水、造紙廢水等工業(yè)廢水的處理中，將其方法借用到水產養(yǎng)殖環(huán)境修復應用中來，也不失為一種捷徑。本研究就是基于此理論基礎，先分離出一株具有較強能力的異養(yǎng)型氨氧化細菌，在此基礎上在分離出一株能利用Na2S的細菌，以期在同一環(huán)境中實現對氨氮和硫化物的同步去除作用。

[1]李曉敏,曲克明,孫 耀,等．海水養(yǎng)殖沉積環(huán)境硫化物污染及修復[J]．海洋水產研究,2005,26(6):89-93．

[2]KUENENJ G,ROBERTSON I A.The use of natural bacterial populationgs for treatment of sulfur containing wastewater[J].Biodegradation,1992(3):239-254．

[3]王愛杰,杜大仲,任南琪,等．脫氮硫桿菌在廢水脫硫、脫氮處理工藝中的應用[J].哈爾濱工業(yè)大學學報,2004,36(4):423-429．

[4]彭光浩,尹瑞齡,張桂英.分離鑒定純化異養(yǎng)硝化微生物的方法:中國,03118598[P].2003-08-06．

[5]東秀珠,蔡妙英．常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]．北京:科學出版社,2001:106-120．

[6]殷永翔．API鑒定系統(tǒng)極其在細菌學檢驗中的應用[J]．現代預防醫(yī)學,2004,31(5):729-731．

[7]葛蕓英,陳 松,胡 蘭,等.土壤細菌DNA提取及多樣性分析的T-RFLP方法[J].微生物學通報,2008,35(1):131-136．

[8]BAVYKIN S G,LYSOV Y P,ZAKHARIEV V,et al.Use of 16S rRNA,23S rRNA,and gyrB gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microorganisms[J].J Clin Microbiol,2004,42(8):3 711-3 730．

[9]HOLT J G,KRIEG N R,SNEATH P H A,et al．Bergey′s manual of determinative bacteriology．Ninth edition[M].Baltimore:Williams and Wilkins,1994,192:253;256-257．

[10]KRIEG N R,HOLT J G.Bergey′s manual of systematic bacteriology.Volume 1[M].London:Williams and Wilkins,Baltimore,1984:545-548．

[11]國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心．GB 17378.4-2007中華人民共和國國家標準海洋監(jiān)測規(guī)范第4部分:海水分析 [M].北京:中國標準出版社,2008:101-103．

[12]MORIARTY D J W,NICHOLAS D J D.Enzymic sulphide oxidation by Thiobacillus concretivorus[J].Biochem Biophys Acta,l969,l84:1l4-123．

[13]FUKUMORI Y,YAMANAKA T.Flavocytochronle C of Chromatium vinosum[J].J Biochem,1979,85:1 405-1 414．

[14]SUGIO T,MIZUNASHI W,INAGAKI K,et a1.Purification and some properties of sulfur:ferric ion oxidoreductase from Thiobacillus ferrooxidans[J].J Baeterio1,1987,169:4 9l6-4 922．

[15]CHAN C W,SUZUKI I.Quantitative extraction and determination of elemental sulfur and stoichiometric oxidation of sulfide to elemental sulfur by Thiobacillus thiooxidans[J].Can J Microbiol,1993,39:1 166-1 168．

[16]VAN DEN EMDE F P,VEN GEMERDEN H.Sulfide oxidation under oxygen limitation:a Thiobacillus thioparus isolated from a marine mierohial mat[J].FEMS Microbio1 Eco1,1993,13:69-78.

[17]OHTA Y,SUMIDA K,NAKADA Y.Purification and properties of a sulfide-oxidizing enzyme from Streptomyces sp．Strain SH91[J].Can J Microbio1,1997,43:l 097-l 101．

[18]WIRSEN C O,SIEVERT S M,CAVANAUGH C M,et a1.Characterization of an Autotrophic sulfide oxidizing marine Arcobacter sp.That produces filamentous sulfur[J]．App1 Environ Microbio1,2002,68:316-325．

[19]吳后波,潘金培.弧菌屬及其所致海水養(yǎng)殖動物疾病[J].中國水產科學,2001,8(1):89-93.

[20]周世明,舒為群,趙 清.發(fā)光菌在水環(huán)境污染物檢測中的應用研究進展[J].環(huán)境與健康雜志,2007,24(10):837-839.

[21]BISOGNI JR J J,DRISCOLL JR C T．Denitrification using thiosulfate and sulfide[J].Journal of Environmental Engineering,1977,103:593-604.