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    注射用糜蛋白酶的比活與純度研究

    2012-10-19 14:50:08上海醫(yī)藥工業(yè)研究院200040史卓維
    首都食品與醫(yī)藥 2012年6期
    關(guān)鍵詞:馬斯亮凱氏定氮糜蛋白酶

    上海醫(yī)藥工業(yè)研究院(200040)史卓維

    上海市食品藥品檢驗(yàn)所(201203)史芳亮 陳鋼Δ

    糜蛋白酶(Chymotrypsin),又稱胰凝乳蛋白酶,系從?;蜇i胰腺中提取的一種蛋白水解酶,具有肽鏈內(nèi)切酶的作用,臨床上主要用于眼科手術(shù),也可用于創(chuàng)口或局部炎癥,以減少局部分泌和水腫[1]。注射用糜蛋白酶為無菌凍干粉末,輔料為20%甘露醇和右旋糖酐20,現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為2010版中國藥典。

    比活是單位蛋白質(zhì)重量下的酶活力,它是在理化方法無法控制酶的純度或有關(guān)物質(zhì)時可采用的最有效的控制酶純度的方法之一。由于注射用糜蛋白酶現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有效價測定,而沒有比活或者純度檢查項(xiàng),因此無法對企業(yè)低效價原料多投料的情況進(jìn)行監(jiān)控,從而可能對患者的用藥安全性造成潛在危害。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未有注射用糜蛋白酶比活測定與純度測定方法的報道。本文旨在分別建立一種適用于注射用糜蛋白酶比活測定的方法以及RP-HPLC純度測定方法。

    1 儀器與試藥

    Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司),Spectra max 340pc酶標(biāo)儀(美國分子儀器公司),F(xiàn)oss Kjeltec 2400自動凱氏定氮儀(瑞典FOSS公司),UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司),瑞士Mettler Toledo AB204-S電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司),Grace 214TP C4色譜柱(250mm×4.6mm,5μm,美國格雷斯公司)。

    附表1 凱氏定氮法加樣回收率測定結(jié)果

    附表4 注射用糜蛋白酶RP-HPLC純度測定結(jié)果

    考馬斯亮藍(lán)試劑盒(貨號23200,美國Thermo公司),BCA試劑盒(貨號QPBCA,美國Sigma公司),牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA,批號14619-200919,中國藥品生物制品檢定所),USP糜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品(貨號1134007,美國藥典會),硫酸銅、酒石酸鈉、氫氧化鈉、碳酸鈉、硫酸銨均為分析純,乙腈、三氟乙酸為色譜純,水為去離子水。

    注射用糜蛋白酶共5個批號,規(guī)格均為4000單位/瓶,批號為20090709、20110315、20110316和批號為0905031、1101021的制劑來自兩家國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)。

    2 比活測定方法

    比活是單位蛋白質(zhì)重量下的酶活力,因此要分別測定每瓶制劑中的總蛋白量以及酶活力(即效價)。

    2.1 凱氏定氮法 取各批號樣品5瓶,用適量水完全轉(zhuǎn)移至定氮管中,120℃濃縮至5ml左右后,參照中國藥典2010版二部附錄Ⅶ M蛋白質(zhì)測定法中的凱氏定氮法測定總氮,按照中國藥典2010版三部附錄Ⅵ B中三氯乙酸法測定非蛋白氮。根據(jù)公式:蛋白氮=總氮-非蛋白氮、真蛋白=蛋白氮×氮轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)的系數(shù)6.25[2]計(jì)算得到每瓶制劑中所含的總蛋白量。

    2.2 考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)、2,2’-聯(lián)喹啉-4,4’-二羧酸法(BCA法) 將各批號樣品用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為250μg/ml和10μg/ml左右,然后分別參照Bradford和BCA試劑盒說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。

    2.3 福林酚法 將樣品用水稀釋至蛋白質(zhì)濃度為100μg/ml左右,參照中國藥典2010版二部附錄Ⅶ M蛋白質(zhì)測定法中的福林酚法進(jìn)行操作。

    2.4 比活計(jì)算 按照2010版中國藥典二部中注射用糜蛋白酶效價測定項(xiàng)下的方法對5批制劑進(jìn)行效價測定,再結(jié)合所測得的總蛋白量計(jì)算比活,公式:比活(單位/mg)=效價(單位/瓶)/蛋白質(zhì)含量(mg/瓶)。

    3 純度測定方法

    3.1 溶液的制備

    3.1.1 對照品溶液 取USP糜蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品,加0.1%三氟乙酸水溶液溶解并稀釋制成1mg/ml的溶液。

    3.1.2 供試品溶液 取樣品,加0.1%三氟乙酸水溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含1000單位的溶液。

    3.1.3 空白輔料溶液 按2家生產(chǎn)企業(yè)的處方稱取輔料,用0.1%三氟乙酸水溶液溶解并稀釋制成不含糜蛋白酶的空白輔料溶液。

    3.2 色譜條件 色譜柱采用Grace 214TP C4色譜柱(250mm×4.6mm,5μm),流動相為0.09%三氟乙酸水溶液(A)和0.1%三氟乙酸乙腈(B),梯度洗脫[0~5min,A:B維持95:5不變;5~30min,A:B比例從95:5下降至40:60;30~40min,A:B比例維持40:60不變],流速1.0ml/min,檢測波長214 nm,進(jìn)樣量10μL,柱溫30℃。

    4 比活結(jié)果

    4.1 輔料干擾試驗(yàn) 由于甘露醇與右旋糖酐20均不含氮元素,因此不會對凱氏定氮法造成影響。采用考馬斯亮藍(lán)法對空白輔料溶液進(jìn)行測定時,輔料溶液無紫外吸收。而采用BCA法和福林酚法時,空白輔料溶液有明顯紫外吸收,因此會影響樣品的測定,故排除BCA法和福林酚法,僅對凱氏定氮法和考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)。

    4.2 方法學(xué)試驗(yàn)

    4.2.1 準(zhǔn)確度 用水分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移5瓶供試品(批號20090709)至定氮管中,按低、中、高濃度分別精密加入10.0mg/ml的硫酸銨溶液0.5ml,1.0ml,1.5ml,參照“2.1”項(xiàng)下方法操作。所得的加樣回收率結(jié)果見附表1。

    取供試品(批號20090709)用水溶解并稀釋成蛋白質(zhì)濃度約為250μg/ml的溶液,取該溶液1ml,分別與250μg/ml的BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品0.5ml,1.0ml,1.5ml混勻后,按考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書上方法操作,所得加樣回收率的結(jié)果見附表2。

    4.2.2 精密度

    4.2.2.1 重復(fù)性 取供試品(批號20090709)5瓶,參照“2.1”項(xiàng)下方法連續(xù)測定6次,滴定蛋白氮所消耗的硫酸量的SD為0.2054,RSD為1.25%,置信度為0.95的置信區(qū)間為[16.1870,16.5972]。

    取供試品(批號20090709),用水溶解并稀釋成蛋白質(zhì)濃度約為200μg/ml的溶液,參照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書方法上連續(xù)測定6次,測得吸光度的SD為0.005,RSD為0.89%,置信度為0.95的置信區(qū)間為[0.518,0.528]。

    4.2.2.2 中間精密度

    附表2 考馬斯亮藍(lán)法加樣回收率測定結(jié)果

    附表3 注射用糜蛋白酶的蛋白質(zhì)含量和比活結(jié)果

    取供試品(批號20090709),參照“2.1”項(xiàng)下方法每天平行測定6次,連續(xù)測定3d,記錄消耗的硫酸量并計(jì)算蛋白質(zhì)含量,日間精密度RSD為0.95%。

    取供試品(批號20090709),用水溶解并稀釋成蛋白質(zhì)濃度約為200μg/ml的溶液,參照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書方法上每天平行測定6次,連續(xù)測定3d,記錄吸光度值并計(jì)算蛋白質(zhì)濃度,日間精密度RSD為1.33%。

    4.2.3 考馬斯亮藍(lán)法線性考察 照考馬斯亮藍(lán)試劑盒說明書配制標(biāo)準(zhǔn)曲線,日內(nèi)重復(fù)配制并測定5次,以BSA的濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為Y=0.0007X+0.0135,相關(guān)系數(shù)為0.9978。

    4.2.4 考馬斯亮藍(lán)法耐用性 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)品和供試品與考馬斯亮藍(lán)試液混合后,顏色均會隨著放置時間的增加而加深,但對標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性和蛋白質(zhì)含量結(jié)果的計(jì)算并沒有影響。因此,為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,每次進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定時,都要平行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    4.3 樣品測定結(jié)果 采用凱氏定氮法和考馬斯亮藍(lán)法測得的蛋白質(zhì)含量結(jié)果與計(jì)算得到的比活結(jié)果見附表3。我們對兩種方法得到的蛋白質(zhì)含量結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)二者存在較顯著的正相關(guān)(r=0.875,P<0.01,n=5)。

    5 純度結(jié)果

    5.1 方法選擇性 本文考察了2家生產(chǎn)企業(yè)的空白輔料處方溶液,均無干擾。主成分與相鄰雜質(zhì)的色譜峰均能達(dá)到基線分離,分離度大于1.5。

    5.2 破壞性試驗(yàn) 取樣品(批號20110316),分別加入0.1mol/L氫氧化鈉溶液1.0ml、0.1mol/L鹽酸溶液1.0ml和30%過氧化氫溶液1.0ml,放置1小時,再加入0.1mol/L鹽酸溶液1.0ml、0.1mol/L氫氧化鈉溶液1.0ml和0.1%三氟乙酸水溶液1.0ml,混勻,分別作為堿、酸、氧化破壞的樣品溶液,另取同一批號樣品于60℃水浴中放置1小時,再加0.1%三氟乙酸水溶液2ml,作為熱破壞試驗(yàn)的樣品溶液。將以上溶液按“3.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣,結(jié)果表明,樣品對堿、氧化最不穩(wěn)定,其次為酸,樣品對熱最穩(wěn)定。30%過氧化氫可使樣品直接沉淀變性。各降解產(chǎn)物與主成分峰均有良好分離,不影響純度的測定。

    5.3 精密度試驗(yàn) 取“3.1.1”項(xiàng)下的糜蛋白酶對照品連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,峰面積的RSD為0.07%。

    5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“3.1.2”項(xiàng)下配制6份供試品(批號20110316)溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,樣品純度的RSD為0.11%。

    5.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“5.4”項(xiàng)下供試品溶液,置4℃恒溫的Agilent 1200高效液相色譜儀自動進(jìn)樣器中放置,分別于0、3、6、9、12、15、18、24小時進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,按峰面積歸一化法計(jì)算純度。8次測得的純度結(jié)果的平均值為86.59%,RSD=0.14%,說明樣品在0.1%三氟乙酸流動相中穩(wěn)定。

    5.6 樣品測定 取樣品,照“3.1”項(xiàng)下方法配制溶液后,精密量取各10μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖。按歸一化法計(jì)算主峰的純度,各批號樣品的純度結(jié)果見附表4。

    5.7 比活與純度結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 將凱氏定氮法得到的制劑比活與用RP-HPLC法測得的純度結(jié)果進(jìn)行直線相關(guān)性的考察,發(fā)現(xiàn)二者存在顯著的正相關(guān),r=0.940,P<0.01,n=5。

    6 討論

    6.1 蛋白質(zhì)含量測定方法的選擇 通過輔料干擾試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),福林酚法和BCA法均不適用于該品種的制劑測定,而考馬斯亮藍(lán)法和凱氏定氮法無輔料干擾,可以用于注射用糜蛋白酶的蛋白質(zhì)含量測定。

    考馬斯亮藍(lán)法測得的總蛋白質(zhì)含量明顯低于凱氏定氮法,這可能是由于反應(yīng)機(jī)制造成的,據(jù)報道[3],采用考馬斯亮藍(lán)法對堿性蛋白酶酶解前后的牛血清白蛋白進(jìn)行含量測定,發(fā)現(xiàn)酶解后的蛋白質(zhì)含量測定值大幅度下降,說明當(dāng)供試品中含有混合蛋白質(zhì)和多肽時,考馬斯亮藍(lán)法僅對蛋白質(zhì)有顯色反應(yīng)。由于待測樣品是主成分與雜蛋白和雜多肽的混合物,我們要測的總蛋白量不僅包括大分子蛋白還包括樣品中的雜多肽,因此凱氏定氮法更適合注射用糜蛋白酶中總蛋白量的測定。

    6.2 比活與純度的相關(guān)性考察 比活與純度結(jié)果的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示二者存在顯著的正相關(guān),由于酶的提取效果越好,純度也越高,單位蛋白質(zhì)重量下的活力(即比活)也高,提高比活即提高了該酶的純度,而比活或純度值越高,酶制劑所投原料的質(zhì)量就越高。由于本品純度較高,能夠通過液相色譜方法進(jìn)行純度控制,考慮到方法的簡便性,可以用純度代替比活來控制原料質(zhì)量。對于其它組分較為復(fù)雜的生化類藥物,在沒有理化手段控制樣品純度時,則可以通過測定比活來監(jiān)控制劑的投料質(zhì)量及控制純度。

    7 小結(jié)

    本文通過對各種蛋白質(zhì)含量測定法的篩選[4],最終選定凱氏定氮法用于注射用糜蛋白酶中總蛋白質(zhì)含量的測定,并計(jì)算出比活。同時也建立了RP-HPLC測定注射用糜蛋白酶純度的方法。兩法所得結(jié)果間存在著顯著的正相關(guān),即比活越高,純度越高。對于多組分的生化藥物,在主成分能與雜質(zhì)分離的情況下,可采用純度法來控制投料質(zhì)量,而對于成分復(fù)雜無法用理化手段控制質(zhì)量的樣品,則可考慮用比活代替純度來進(jìn)行質(zhì)量控制。

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