ELISA方法檢測(cè)犬瘟熱抗體初探

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)展學(xué)院 劉 蓓 高瑞峰 宋繼偉

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的犬及其他食肉動(dòng)物的一種急性、高度傳染性、致死性疫病。該病臨床癥狀以結(jié)膜炎、雙相熱、嚴(yán)重的胃腸炎及神經(jīng)癥狀等為主要特征 （Beineke等，2009）。犬瘟熱可對(duì)世界范圍的犬類造成嚴(yán)重的危害，盡管全世界針對(duì)該疫病都進(jìn)行免疫，但是CDV仍然對(duì)犬有極高的發(fā)病率和致死率。通過血清中抗體水平的升高，可以區(qū)分感染與未感染的動(dòng)物。因此，檢測(cè)動(dòng)物機(jī)體血清中抗體滴度，對(duì)于決定是否需要免疫是一種有效的方法。目前，檢測(cè)動(dòng)物血清中CDV抗體水平主要應(yīng)用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）和血清中和實(shí)驗(yàn)（SN），這兩種方法均存在操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力、對(duì)操作人員及儀器要求較高等缺點(diǎn)，因此迫切需要研究出一種操作快速簡(jiǎn)便且特異、靈敏度高的檢測(cè)方法。本研究用細(xì)胞培養(yǎng)的犬瘟熱病毒作為包被抗原，建立了檢測(cè)犬瘟熱抗體的間接ELISA方法，為免疫犬群的抗體檢測(cè)和犬瘟熱流行病學(xué)調(diào)查提供一種快速簡(jiǎn)便的血清學(xué)診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑、血清和抗原 SPA辣根過氧化物酶 （HRP）結(jié)合物 （sigma公司），工作效價(jià)1∶5000；CDV陽性血清為本實(shí)驗(yàn)室自制，CDV陰性血清為未免疫貉子血清；CDV Onderstepoort株、Vero細(xì)胞本室保存；羊抗犬免疫球蛋白辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物，購自Sigma公司，工作效價(jià)1∶5000；TMB 為 Sigma公司（美國(guó)）產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 SUNRISE型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，瑞士Tecan公司生產(chǎn)；ND-1000全波長(zhǎng)/可見光掃描分光光度計(jì)，美國(guó)NanoDrop公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 間接ELISA工作條件的初步確定 按常規(guī)方法，建立ELISA的程序：用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋CDV抗原至工作濃度 （1∶100），0.1 mL/孔，包被板，37 ℃包被 3 h，4 ℃包被18 h，用含0.05%Tween-20的PBST洗板5次，每次1 min。加含5%脫脂乳的封閉液，0.2 mL/孔，37℃封閉1 h，PBST洗板5次，每次1 min。加入1∶160 稀釋的待檢血清，0.1 L/孔，37 ℃，1 h，PBST洗板5次，每次1 min。加入1∶5000稀釋的酶標(biāo)抗體，37℃，1 h，PBST洗板5次，每次1 min。 加入底物（磷酸-檸檬酸緩沖液+TMB），0.1 mL/孔，37 ℃，避光顯色15 min。加終止液終止反應(yīng)，BIORAD680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)A620值 （楊敬等，2005；曹澎澤，1992）。

1.2.2 包被抗原的制備 取Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的CDV病毒，凍融3次后4000 r／min離心30 min，將收獲的病毒培養(yǎng)上清用透析袋濃縮20倍，在20%、35%、50%蔗糖梯度上，40000 r／min離心 2 h收取病毒組分。用分光光度計(jì)測(cè)定病毒蛋白含量。

1.2.3 間接ELISA工作條件的優(yōu)化

1.2.3.1 抗原最佳包被濃度和包被條件的選擇將純化的抗原稀釋到40 μg/mL，之后作倍比稀釋， 稀釋后的濃度分別為 0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL。包被條件分別為：37 ℃作用 3 h 后，置4℃冰箱過夜包被，直接置4℃冰箱過夜包被；37℃作用3 h后包被；之后按間接ELISA方法進(jìn)行，測(cè)定各孔A620值。

1.2.3.2 血清最佳稀釋濃度和作用時(shí)間的選擇將 CDV 陽性血清作 1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶300和1∶400倍稀釋。血清的作用時(shí)間分別為30、40、50、60、80 min。

計(jì)算陽性血清與陰性血清在不同抗體濃度下的OD650值之差，以O(shè)D650值之差最大的血清稀釋度為最適稀釋度（沈敏等，1997）。

1.2.3.3 酶標(biāo)抗體及其工作濃度的選擇 將SPA、SPG 和 SPA/SPG 的混合物分別作 1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶5000、1∶10000 倍稀釋，加到酶標(biāo)板的各孔中，在其他程序相同條件下，比較各組陰陽性血清的P/N值，確定酶標(biāo)抗體的類型和最佳工作濃度。

1.2.3.4 封閉液及封閉時(shí)間的選擇 在其他程序相同條件下，分別用0.1%、1%的BSA，0.1%、1%的明礬，1%、5%、10%的脫脂乳封閉。封閉液的作用時(shí)間分別為 30、40、60、80、120 min，比較各組陰陽性血清的P/N值，確定封閉液的類型和最佳工作濃度。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 阻斷實(shí)驗(yàn) 將8份CDV陽性血清和2份陰性血清均1∶80稀釋，每份血清稀釋2管，每管0.1 mL，其中1管加入特異抗原0.1 mL，濃度為包被抗原的10倍；另外1管加0.1 mL PBS作對(duì)照，各管置37℃作用1 h后，每管吸出0.l mL加入包被好的酶標(biāo)板孔內(nèi)，按照ELISA操作程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按以下公式計(jì)算抑制率：

抑制率=（未吸收A值-特異抗原吸收后A值）/未吸收A值，若此值大于0.5，可確證阻斷陽性。

1.2.4.2 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 其他條件不變，用豬圓環(huán)病、雞新城疫病、兔血清各5份進(jìn)行ELISA檢測(cè)，觀察結(jié)果。

1.2.4.3 敏感性實(shí)驗(yàn) 用ELISA檢測(cè)試紙條和已建立的ELISA方法，檢測(cè)30份臨床送檢貉子、狐貍血清的CDV抗體，比較兩種方法的符合率。

1.2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將陽性和陰性病料各10份進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用已建立的ELISA方法每隔1月在相同條件下重復(fù)檢測(cè)，比較測(cè)定結(jié)果（王玉玲，2005）。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA最佳工作條件的確定

2.1.1 犬瘟熱抗原最佳包被濃度的選擇 由圖1可見，將ELISA抗原梯度稀釋，在稀釋范圍內(nèi)，其包被量的OD值與包被濃度呈明顯的劑量依賴關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)確定抗原最適包被濃度為5 μg/mL。各種包被條件中，直接置4℃冰箱過夜包被效果最好。

圖1 抗原最佳工作濃度選擇

2.1.2 血清最佳稀釋濃度和作用時(shí)間的選擇 試驗(yàn)結(jié)果表明待檢血清為1∶100倍稀釋，血清作用時(shí)間為50 min時(shí)，N/P值最大。

2.1.3 酶標(biāo)抗體及其工作濃度的選擇 SPA在稀釋度為1∶5000時(shí)陰陽性血清的P/N值最小，所以實(shí)驗(yàn)選定1∶5000稀釋倍數(shù)的SPA為二抗。

2.1.4 封閉液及封閉時(shí)間的選擇 用含1%脫脂乳的PBS-Tween-20作為封閉液，封閉40 h效果最好，因?yàn)榇藭r(shí)檢測(cè)樣本與對(duì)照的OD值相差最大，說明較好地封閉了非特異性結(jié)合位點(diǎn)。

2.2 阻斷實(shí)驗(yàn) 用特異抗原與血清作用后，其OD值顯著降低，陰性血清阻斷率為0，8份陽性血清的阻斷率為0.753～0.856，阻斷為陽性，說明該法具有較好的特異性（表1）。

2.3 敏感性實(shí)驗(yàn) 用ELISA檢測(cè)試紙條和已建立的ELISA方法，檢測(cè)臨床送檢貉子、狐貍血清30份，試紙條檢測(cè)30份血清中，陰性血清13份，陽性血清17份，陰性檢出率為13/30，陽性檢出率為17/30。已建立的ELISA方法檢測(cè)這批血清中陰性血清11份，陽性血清19份，陰性檢出率為11/30，陽性檢出率為19/30。證明本實(shí)驗(yàn)建立的犬溫?zé)崛《究乖璄LISA方法具有較高的敏感性。

表1 阻斷試驗(yàn)結(jié)果

2.4 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn) 其他條件不變，用豬圓環(huán)病、雞新城疫病、兔血清各5份進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明，豬圓環(huán)病、雞新城疫病、兔血清均為陰性。說明犬瘟熱ELISA試驗(yàn)與豬圓環(huán)病、雞新城疫病、兔血清無交叉反應(yīng)。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)10份標(biāo)準(zhǔn)陽性病料和10份標(biāo)準(zhǔn)陰性病料進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在10個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，相同條件下進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，結(jié)果均一致，表明本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨界點(diǎn)確定 用建立的ELISA方法，檢測(cè)采自無犬瘟熱病毒感染場(chǎng)的200只健康狐、貉子血清，分別進(jìn)行ELISA檢測(cè)，計(jì)算出每一樣品的S/P值（樣品OD值/標(biāo)準(zhǔn)陽性血清OD值），使用平均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差（99.7%可信度）公式計(jì)算出臨界點(diǎn)為0.239。

3 結(jié)論

本研究初步建立了Vero細(xì)胞培養(yǎng)的犬溫?zé)岵《緸榛A(chǔ)的間接ELISA方法，結(jié)果表明本方法用于血清犬溫?zé)峥贵w檢測(cè)，特異性、敏感性均較好，但還需要通過大量的血清樣品檢測(cè)，以進(jìn)一步確定其敏感性和特異性。

[1]曹澎澤.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992.

[2]沈敏，王新華，周鵬飛，等.BVD-MDV細(xì)胞毒的快速粗提[J].中國(guó)畜禽傳染病，1997,4：58 ～ 59.

[3]王玉玲.犬細(xì)小病毒HL-1株VP2基因真核表達(dá)及抗體ELISA檢測(cè)方法的建立：[碩士學(xué)位論文][D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[4]楊敬,烏仁高娃,范薇,等.間接ELISA檢測(cè)犬瘟熱血清抗體方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005,26 （11）：61 ～ 64.

[5]Beineke A，Puff C，Seehusen F，et al.Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine distemper[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，127：1 ～ 18.