安腦丸對實驗性腦出血大鼠的保護作用

梁 慧 王 鄭 梅元武

目前，腦出血是臨床上常見的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其病死率、殘廢率較高，幸存者常遺留有不同程度的高級神經(jīng)功能缺損，嚴重影響患者生活質(zhì)量，且近年來其發(fā)病率有逐漸提高及平均發(fā)病年齡有年輕化的趨勢，因此對于腦出血的研究具有十分重要的社會價值和臨床意義。腦出血后腦損傷除了血腫本身引起的占位效應外，還包括凝血素產(chǎn)生的凝血連鎖反應、紅細胞裂解后血紅蛋白誘導的毒性反應、炎性反應及小膠質(zhì)細胞的激活、神經(jīng)細胞的凋亡等引起的繼發(fā)性腦組織損傷［1］，故通過抑制炎性反應、減少神經(jīng)細胞的凋亡、促進神經(jīng)元的恢復與再生等可以減輕腦出血后腦組織損傷。核因子-kB（NF-kB）是一種廣泛存在、功能多樣的核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種炎癥相關基因的表達和調(diào)控，與腦缺血再灌注損傷的炎癥機制密切相關［2，3］。神經(jīng)生長相關蛋白-43（GAP-43）是一種特異性地與神經(jīng)細胞生長、發(fā)育和再生相關的磷酸蛋白，可促進神經(jīng)元的生長發(fā)育、再生和突觸的重構。半胱氨酸天冬氨酸中等異性蛋白酶-3（Caspase3）是目前已知的凋亡執(zhí)行的關鍵因子，在凋亡過程中水解DNA、組織蛋白，通過抑制Caspase3后可大大減輕凋亡［4］。安腦丸主要是由人工牛黃、水牛角濃縮粉、豬膽汁粉、黃連、黃芪、梔子、石膏、郁金、薄荷腦、珍珠母、珍珠、赭石、冰片組成，是在中藥安宮牛黃丸的基礎上研制演變而來的；與安宮牛黃丸相比，其具有以下優(yōu)勢特點：用人工牛黃替代了天然牛黃、豬膽汁粉和水牛角濃縮粉替代犀牛角解決了安宮牛黃丸中的貴稀料受限問題，增加了薄荷腦、石膏、赭石、珍珠母而強化祛痰清熱作用，且去掉了重金屬，使用藥更安全；其中，黃連、黃芪、梔子可清熱解毒、瀉火除煩；冰片有擴張軟化血管、改善血腦屏障通透性、增強藥物向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運作用，故本研究通過觀察安腦丸對實驗性腦出血大鼠血腫周圍 NF-kBp65、GAP-43、Caspase3表達水平的影響，研究安腦丸對腦出血后神經(jīng)細胞的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠190只，體重（220±20）g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心提供。190只大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、安腦丸組，正常組10只大鼠，5只用于免疫組化檢測，5只用于Western blot檢測；其余每組60只大鼠，按每個時間點10只隨機分為術后12 h、1、2、4、7、10 d六個時間點進行處理，每個時間點5只用于免疫組化檢測，5只用于western blot檢測。正常組：正常飼養(yǎng)，自由飲水；假手術組：用生理鹽水代替膠原酶注入蒼白球后，正常飼養(yǎng)及自由飲水；模型組：大鼠造模后正常飼養(yǎng)及自由飲水；安腦丸組：大鼠造模后安腦丸灌胃，各組均在術前6 h灌胃1次（1 mg／ml，10 ml／kg），且在大鼠手術清醒后開始灌胃，每天上下午各1次，直至處死。

1.2 實驗材料

Ⅶ型膠原酶（sigma公司）、安腦丸（由哈爾濱蒲公英藥業(yè)有限公司提供）、鼠抗體免疫組化（DAB）試劑盒（北京欣博盛生物科技公司）、caspase3抗體、NF-kBp65 抗 體 （GeneTex 公 司 ）、STOELTING TL-2型鼠腦立體定位儀（美國）、光學顯微鏡（日本Olympus公司）、微量進樣器、手術鑷、手術剪等手術器械（上海醫(yī)療器械廠）。

1.3 腦出血模型的制作

按照Rosenberg法制作大鼠腦出血模型［5］：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于腦立體定位儀上，根據(jù)《大鼠立體定位圖譜》［6］進行蒼白球定位：前囟后1.4 mm，矢狀線右側旁開3.2 mm，在顱骨表面開一小孔，向下進針5.6 mm，通過微量注射器向右側蒼白球內(nèi)緩慢注射含有0.2 U／μl的Ⅶ性膠原酶的生理鹽水2μl，留針5 min。假手術組用生理鹽水代替膠原酶，過程同前。

1.4 動物行為學及神經(jīng)功能缺損評分

術后大鼠清醒后按Longa［7］等創(chuàng)立的5級神經(jīng)功能缺損評分方法進行神經(jīng)功能缺損評分。0級：無神經(jīng)功能缺陷；1級：不能完全伸展缺血對側前肢（為輕度局灶神經(jīng)功能缺損）；2級：向缺血對側轉(zhuǎn)圈（為中度局灶神經(jīng)功能缺損）；3級：向缺血對側傾倒（為重度局灶神經(jīng)功能缺損）；4級：不能自發(fā)行走，昏睡。神經(jīng)功能評分在2級以上的大鼠視為造模成功，納入實驗，剔除神經(jīng)功能評分0級或4級者，并予以補充。

1.5 免疫組化染色

將大鼠用10%水合氯醛麻醉后迅速打開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室插管至升主動脈，剪開右心耳，快速灌入200 ml左右生理鹽水，再用4℃預冷的4%多聚甲醛溶液400 ml，先快后慢進行灌注固定，取腦固定于同樣4%多聚甲醛內(nèi)過夜固定，再置入20%、30%蔗糖溶液，待組織沉底后人恒冷切片機進行連續(xù)冠狀位切片，片厚約30μm，保存?zhèn)溆?。切片放?%H2O2溶液，室溫1 h，以消除內(nèi)源性過氧化物酶；正常羊血清室溫封閉30 min；分 別 加 入 兔 抗 NF-kBp65、兔 抗 GAP-43、兔 抗Caspase3一抗，4℃孵育24 h；分別滴加二抗工作液（NF-kBp65、GAP-43、Caspase3抗兔）室溫反應30 min；滴加辣根酶標記卵白素工作液，室溫反應30 min；DAB顯色劑顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗3次終止反應；以上操作除滴加封閉液后勿洗之外，其他步驟之間均用0.1 mol／LPBS清洗5 min×5次。對照試驗用PBS代替一抗進行實驗。每個指標每組每個時間點取5張切片，在每張切片的陽性細胞區(qū)域隨機選取5個不同視野，400倍光鏡下計算每個視野的陽性細胞數(shù)目，取平均值代表該張切片陽性細胞數(shù)；同法計數(shù)每組各時間點切片的陽性細胞數(shù)，總平均數(shù)代表該組時間點的陽性細胞數(shù)。

1.6 Western blot檢測

各組每個時間點各取5只大鼠用10%水合氯醛麻醉，快速取腦，用刀片切取腦血腫周圍腦組織塊置入勻漿器中，剪碎，加單去污劑裂解液400 ul，勻漿，置于冰上30 min后移置1.5 ml離心管中，在4℃下12 000 r／min離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆茫肂radford法測蛋白含量，并調(diào)節(jié)蛋白濃度。等量蛋白樣品（50 μl）經(jīng)10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜后室溫下封閉2 h，加入Caspase3一抗，置4℃過夜后，加入相應辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗，室溫搖床2 h后采用增強型化學發(fā)光顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，測定灰度值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分

按Longa神經(jīng)功能缺陷評分法在手術大鼠清醒后2 h進行神經(jīng)功能缺損評分，模型組和安腦丸組均出現(xiàn)明顯偏癱癥狀，安腦丸組在4個時間點評分均優(yōu)于模型組（P＜0.05）；正常組及假手術組大鼠清醒后均無明顯肢體運動障礙（表1）。

2.2 免疫組化法檢測NF-kBp65陽性細胞表達水平

NF-kBp65表達以細胞漿或細胞核呈黃褐色為陽性細胞，腦出血腦組織中NF-kBp65陽性細胞主要表達于血腫周圍區(qū)及出血側皮質(zhì)。正常組和假手術組腦組織內(nèi)NF-kBp65陽性表達極少，兩組間無顯著性差異（P＞0.05）；模型組與安腦丸組NF-kBp65陽性細胞數(shù)較正常組和假手術組多（P＜0.01）；模型組與安腦丸組腦出血后12 h NF－kBp65陽性細胞數(shù)明顯增多，4 d時NF-kBp65陽性細胞數(shù)達到高峰，10 d時仍可見到NF-kBp65陽性細胞表達，安腦丸組腦出血后各時間點的NF－kBp65陽性細胞數(shù)均明顯少于模型組（P＜0.05）（表2及圖1）。

2.3 免疫組化法檢測GAP-43陽性細胞表達水平

GAP-43陽性細胞表達主要為細胞漿著棕黃色，著色部位主要見于血腫周圍與大腦皮質(zhì)的神經(jīng)元。正常組、假手術組腦組織僅存在少量GAP-43陽性細胞表達，兩者間無顯著性差異（P＞0.05）；模型組和安腦丸組GAP-43陽性細胞數(shù)均較正常組及假手術組多（P＜0.01）；腦出血后12 h模型組GAP-43陽性細胞數(shù)顯著增多，2 d時GAP-43陽性細胞數(shù)達高峰，以后逐漸降低，至第10 d時仍多于正常組（P＜0.01）；腦出血后安腦丸干預組各時間點GAP-43陽性細胞數(shù)均多于模型組（P＜0.01）（表3和圖2）。

2.4 免疫組化法檢測Caspase3陽性細胞表達水平

Caspase3陽性細胞表達主要是胞漿著黃褐色，正常組未見明顯陽性細胞表達，假手術組見到少量Caspase3陽性細胞表達；模型組大鼠腦組織血腫周圍有caspase3陽性細胞表達，大鼠腦出血后12 h即可見到陽性細胞表達，1d陽性細胞數(shù)達到高峰，之后開始下降，10 d時仍有表達，高于正常組（P＜0.01）；模型組、安腦丸組各時間點陽性細胞數(shù)較假手術組明顯增多（P＜0.01）；安腦丸組出血后血腫周圍Caspase3陽性細胞數(shù)明顯低于模型組（P＜0.05）（表4和圖3）。

2.5 Western blot檢測Caspase3蛋白表達水平

腦出血后12h模型組大鼠Caspase3蛋白表達水平明顯升高，1 d時達到高峰，各時間點均明顯高于正常組和假手術組（P＜0.01）；腦出血后安腦丸各時間點Caspase3蛋白表達水平明顯低于模型組（P＜0.01）（圖4）。

表1 4組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，n＝5，分）

表1 4組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較（±s，n＝5，分）

注：與模型組比較，＊P＜0.01

組別神經(jīng)功能缺損評分術后12 h 術后1 d 術后2 d 術后4 d 術后7 d 術后10d正常組000000假手術組 0 0 0 0 0 0模型組 2.64±0.31 2.38±0.26 2.06±0.11 1.90±0.16 1.88±0.13 1.72±0.08安腦丸組 2.38±0.26 2.22±0.13 1.58±0.13＊ 1.48±0.13＊ 1.30±0.07＊ 1.18±0.08＊

表2 各組NF-kBp65陽性細胞數(shù)（±s，n＝5，個／每400倍視野）

表2 各組NF-kBp65陽性細胞數(shù)（±s，n＝5，個／每400倍視野）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01，▲P＜0.05

組別NF-kBp65陽性細胞數(shù)12 h 1 d 2 d 4 d 7 d 10d假手術組 2.88±0.60 2.28±0.51 1.95±0.63 2.24±0.60 1.43±0.39 1.11±0.13模型組 35.20±4.39＊ 48.98±6.02＊ 51.18±8.22＊ 72.98±9.43＊ 39.78±9.20＊ 24.23±7.04＊安腦丸組 28.17±3.34＊▲ 33.00±6.05＊△ 30.51±7.52＊△ 36.41±5.44＊△ 18.62±5.60＊△ 10.76±3.44＊△

表3 各組GAP-43陽性細胞數(shù)（±s，n＝5，個／每400倍視野）

表3 各組GAP-43陽性細胞數(shù)（±s，n＝5，個／每400倍視野）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01

組別GAP-43陽性細胞數(shù)12 h 1 d 2 d 4 d 7 d 10d假手術組 2.28±0.56 2.92±0.44 2.26±0.68 1.98±0.41 1.64±0.47 1.56±0.93模型組 10.08±1.35＊ 20.42±3.08＊ 36.32±3.13＊ 24.32±3.12＊ 18.96±1.92＊ 15.62±3.56＊安腦丸組 19.00±1.41＊△ 33.66±4.37＊△ 59.84±4.06＊△ 60.30±9.19＊△ 34.58±6.40＊△ 28.94±2.69＊△

表4 各組Caspase3陽性細胞數(shù)（±s，n＝5，個／每400倍視野）

表4 各組Caspase3陽性細胞數(shù)（±s，n＝5，個／每400倍視野）

注：與假手術組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01，▲P＜0.05

組別Caspase 3陽性細胞數(shù)12 h 1 d 2 d 4 d 7 d 10d假手術組 3.39±0.83 3.53±1.03 2.66±0.91 2.08±0.57 1.80±0.39 1.59±0.30模型組 30.21±6.98＊ 64.41±8.65＊ 49.48±7.92＊ 41.00±6.71＊ 29.55±4.59＊ 22.21±3.37＊安腦丸組 20.41±3.95＊▲ 42.89±6.25＊△ 31.11±4.29＊△ 21.41±3.61＊△ 14.64±4.14＊△ 10.79±3.40＊△

圖1 腦出血后NF-kBp65陽性細胞數(shù)

圖2 腦出血后GAP-43陽性細胞數(shù)

圖3 腦出血后Caspase3陽性細胞數(shù)

圖4 腦出血后Caspase3蛋白表達水平

3 討 論

NF-kB是一種多向性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)的多種細胞中，如單核巨噬細胞、神經(jīng)細胞、膠質(zhì)細胞等。在正常情況下NF-kB由NF-kBp50和NF-kBp65兩個蛋白亞基組成二聚體，與其抑制物IkB結合，存在于幾乎所有類型細胞胞質(zhì)中，只有受到各種活化因素的作用后才能被激活［8～10］。Wang等研究表明腦出血后NF-kB的活化及表達與繼發(fā)性腦組織損傷有明顯關系［11］，其活化后可促進多種炎癥因子和介質(zhì)的釋放和激活形成復雜的炎癥反應網(wǎng)而加重腦損傷，在腦血管疾病后的炎癥反應中起著中心環(huán)節(jié)的作用［12］，故通過抑制腦出血后NF-kB的表達可以減少腦出血后炎癥反應進而減少腦組織損傷。本研究發(fā)現(xiàn)正常組中僅有極少量NF-kBp65陽性細胞表達，腦出血后12 h血腫周圍NF-kBp65陽性細胞表達明顯增高，4 d時達高峰，10d時仍可見NF-KBp65陽性細胞表達，安腦丸組各時間點NF-kBp65陽性細胞數(shù)均少于模型組（P＜0.01）；故本研究推測安腦丸可以通過抑制NF-kB表達而減少腦出血后炎癥反應，起到一定的神經(jīng)保護作用。

GAP-43是神經(jīng)元特異性胞膜磷酸蛋白，廣泛存在于神經(jīng)組織中，參與神經(jīng)細胞生長及突觸發(fā)育成熟和再生，對于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的軸突生長和突觸形成有重要的作用，被認為是神經(jīng)元生長的內(nèi)在決定因子，是神經(jīng)元可塑性的一種分子標志物，神經(jīng)損傷與再生時軸突內(nèi)其含量可成倍增加［13～15］。腦出血是一種臨床急癥，在腦出血后除了釋放一系列細胞損傷因子外，還可通過釋放一些神經(jīng)營養(yǎng)因子而激活神經(jīng)元的自我保護機制。本研究通過設計膠原酶誘導的腦出血模型，觀察到腦出血后12 hGAP-43表達迅速增高，在2 d時表達達到高峰，而后逐漸降低，一直到腦出血后第10d模型組表達仍明顯高于正常組，而安腦丸組各時間點GAP-43陽性細胞數(shù)均多于模型組（P＜0.05）。因此，本研究推測安腦丸是通過促進血腫周圍神經(jīng)膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元合成GAP-43，作用于自身或鄰近神經(jīng)元進而對缺氧缺血神經(jīng)細胞起保護作用，促進腦出血后神經(jīng)恢復，減輕腦出血后周圍神經(jīng)細胞的壞死。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是一種不同于細胞壞死的細胞死亡形式，是一種機體清除損傷壞死細胞而保持內(nèi)環(huán)境平衡的自我調(diào)節(jié)機制。Karwacki等研究表明實驗性腦出血后血腫中心及其周圍均可發(fā)現(xiàn)大量凋亡的神經(jīng)細胞，故認為細胞凋亡機制可能參與了腦出血繼發(fā)性腦組織損害［16，17］。天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶家族（Caspases）是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，通過對蛋白激酶、核酸酶、細胞骨架蛋白的裂解，激活特定信號系統(tǒng)，導致DNA片段形成、染色質(zhì)固縮等凋亡現(xiàn)象，進而引起細胞凋亡，而Caspase3是Caspases級聯(lián)反應中最重要的共同下游效應分子，是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應中的必經(jīng)之路［18，19］，抑制Caspase3表達后可大大減輕凋亡［2］。本實驗結果顯示腦出血后12 h后大鼠血腫周圍Caspase3表達增加，顯著高于正常組（P＜0.01），1 d時Caspase3表達達到高峰，以后逐漸降低，10 d時表達仍高于正常組和假手術組；安腦丸干預后各時間點Caspase3表達水平均明顯低于模型組（P＜0.01），表明安腦丸可降低腦出血后Caspase3蛋白表達水平，故本研究推測安腦丸可以通過降低Caspase3的表達水平而減少神經(jīng)細胞凋亡進而減少腦出血后神經(jīng)細胞的損害。

綜上所述，本研究推測安腦丸可以（1）通過抑制NF-kB的表達而減少腦出血后腦組織炎性反應；（2）通過促進血腫周圍神經(jīng)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)細胞釋放GAP-43，促進腦出血后神經(jīng)修復與再生，減輕腦出血后周圍神經(jīng)細胞的壞死；（3）通過降低Caspase3蛋白的表達減少神經(jīng)細胞的凋亡，減輕腦出血后腦組織的損害程度三方面對腦出血后腦組織有一定的保護作用。這些證據(jù)為使用安腦丸治療腦出血疾病提供了一定的理論依據(jù)，然而其在臨床應用上的價值還有待進一步的研究證實。

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