Ⅱ型糖尿病腎病模型db/db小鼠血漿的代謝組學(xué)研究

孫立業(yè) 毛 璇 張冬娟 孫 博 管又飛 顏賢忠

1.軍醫(yī)進修學(xué)院，北京 100853；2.國家生物醫(yī)學(xué)分析中心，北京 100850；3.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100083

糖尿病腎?。―N）是糖尿病最常見和最嚴重的并發(fā)癥之一，同時也是導(dǎo)致終末期腎損害的重要因素[1]。目前，臨床上對糖尿病腎病的診斷主要依賴于對尿微量白蛋白排泄率（UAER）的檢測，但因為尿微量白蛋白的含量會受肥胖、胰島素抵抗等諸多因素影響而存在著局限性[2]。糖尿病腎病的發(fā)病機制目前尚無統(tǒng)一定論，當(dāng)前研究主要集中在糖代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激[3-5]等方面。代謝組學(xué)作為一種全面研究生物機體或組織細胞動態(tài)代謝的技術(shù)手段，近年來在疾病的診斷、標(biāo)志物篩查以及發(fā)病機理的研究等方面已有廣泛的應(yīng)用[6-8]。本文采用基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)技術(shù)對db/db糖尿病腎病小鼠血漿中內(nèi)源性小分子代謝物進行分析，結(jié)合模式識別技術(shù)確定糖尿病腎病小鼠機體由于病理刺激而產(chǎn)生的代謝紊亂，進行潛在代謝標(biāo)志物分析，并對其病理機制進行探討，為臨床的診療提供可能的新思路，新方法。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

糖尿病腎病模型db/db小鼠（試驗組）6只，體重（53.9±2.1）g；db/m 小鼠（對照組）6 只，體重（26.8±2.3）g。所有小鼠均為雄性，周齡為14～16周，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供。動物飼養(yǎng)房12 h晝夜交替，溫度為25～27℃，動物自由攝食飲水。

1.2 試劑和儀器

重水（D2O）購自美國 Norell公司；2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸（TSP）購自加拿大默克公司；戊巴比妥鈉和肝素鈉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。VarianUNITYINOVA 600 MHz超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀，購自美國瓦里安公司；Eppendorf 5810R離心機，購自德國Eppendorf公司。

1.3 血漿樣本制備和處理

對小鼠進行解剖，各組小鼠用戊巴比妥鈉（2%，2.5 mL/kg）麻醉后，于心臟動脈取血，使用肝素鈉抗凝，3 500 r/min離心15 min后得到血漿，取250 μL血漿，13 000 r/min離心10 min，取上清液 200 μL，加入 100 μL 的 TSP 重水溶液（1 mg/mL）和300 μL D2O，渦旋混勻后加入至5 mm核磁管中，用于核磁共振檢測。

1.4 核磁共振數(shù)據(jù)采集與預(yù)處理

于27℃下，使用VarianUNITYINOVA 600 MHz超導(dǎo)脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀采集血漿核磁共振一維1H譜，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列抑制由蛋白和脂蛋白等物質(zhì)產(chǎn)生的寬峰，檢測血漿中的小分子代謝物，實驗主要參數(shù)如下：譜寬8 000 Hz、弛豫延遲時間2 s、采樣點數(shù)64 K、累加次數(shù)64次，采用預(yù)飽方式抑制水峰信號。FID信號經(jīng)過傅立葉變換轉(zhuǎn)換為一維1H NMR譜圖，調(diào)整相位并進行基線校正后以乳酸雙峰左側(cè)峰定標(biāo)，化學(xué)位移定為δ1.33。將δ4.4～0.4范圍內(nèi)的譜圖按照每段δ0.002進行分段積分，再將積分按每張譜的總積分強度為10 000進行歸一化，所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件后保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用 MATLAB R2008a（The MathWorks，Inc.，Natick，MA，USA）軟件對積分數(shù)據(jù)進行對齊，采用多元統(tǒng)計分析軟件SIMCA-P12.0+（Umetrics AB，Umea，Sweden）對對齊后的數(shù)據(jù)進行模式識別分析及皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)在進行單位方差（UV scaling）預(yù)處理之后采用正交偏最小二乘判別法（OPLS-DA）進行分析[9]，采用七折交叉驗證法[10-11]（seven-fold cross-validation）來驗證模型的有效性，用R2X和R2Y的值表示模型擬合情況，Q2值表示模型的預(yù)測能力。最后利用MATLAB R2008a軟件做出相關(guān)系數(shù)圖，更直觀也更客觀的發(fā)現(xiàn)組間差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 1H核磁共振譜圖

圖1顯示的為兩組小鼠血漿的核磁共振1H譜，其中A為對照組db/m小鼠，B為試驗組db/db小鼠。主要代謝物已在圖中進行了標(biāo)注，從譜圖中可以明顯觀察到db/db小鼠血漿中葡萄糖顯著升高。

圖1 db/m小鼠（A）與db/db小鼠（B）血漿1H核磁共振譜圖

2.2 多元統(tǒng)計分析

為了更準(zhǔn)確客觀地分析兩組間的差異代謝物，筆者采用了OPLS-DA的方法對數(shù)據(jù)進行了多元統(tǒng)計分析，并用交叉驗證的方法對模型的預(yù)測能力進行評估（R2X=0.452，R2Y=0.992，Q2=0.879）。利用MATLAB軟件做相關(guān)系數(shù)圖，相關(guān)系數(shù)的臨界值相當(dāng)于顯著性水平P=0.05，查閱相關(guān)系數(shù)r臨界值表確定臨界值為0.755，即|r|＞0.755的積分段所代表的代謝物在兩組間有差異。圖2B中顏色越接近紅色，代表此信號對組間區(qū)分貢獻越大，方向則表示含量的增加與減少。從圖2A中可以觀察到兩組小鼠可以被明顯區(qū)分，圖2B則顯示了引起組間差異的代謝物，與對照組db/m小鼠相比，db/db小鼠血漿中葡萄糖和氧化三甲胺（TMAO）的含量升高，脂蛋白、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、乳酸、丙氨酸、賴氨酸、乙酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、檸檬酸、肌酸、肌酐、甘油磷酸膽堿、磷酸膽堿、甘油的含量則下降。見表1。

圖2 db/db（▲）及db/m（■）小鼠血漿核磁共振1H譜的 OPLS-DA結(jié)果

3 討論

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要原因，也是糖尿病主要的死亡原因之一，因此，對于糖尿病腎病的早發(fā)現(xiàn)早治療是至關(guān)重要的。目前，臨床上對糖尿病的診斷主要依靠UAER方法，但這是一個不可逆的過程，當(dāng)患者出現(xiàn)UAER升高時往往已經(jīng)伴隨心血管并發(fā)癥及其他腎臟疾病，錯過了最佳治療時機。筆者利用基于核磁共振的代謝組學(xué)技術(shù)較全面的對樣本中各類代謝物種類及含量的變化特點進行分析，尋找出主要的差異代謝物，對于輔助臨床早期診斷是有重要意義的。

本文的研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病小鼠血漿內(nèi)多種代謝物含量發(fā)生變化，多條代謝通路受到影響。試驗組小鼠血漿中的檸檬酸含量降低，提示三羧酸循環(huán)可能受阻，這一結(jié)果在zuker大鼠[12]和核受體PPAR-缺失小鼠[13]中已有發(fā)現(xiàn)。db/db小鼠血漿中多種氨基酸含量發(fā)生變化，如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甘氨酸，說明糖尿病腎病小鼠體內(nèi)存在氨基酸代謝異常，可能是由于腎小管的重吸收能力下降，導(dǎo)致大量氨基酸流失。其中甘氨酸作為抗氧化劑，可以延緩氧自由基對腎臟的損害，通過調(diào)節(jié)腎臟抗氧化酶、Na+-K+-三磷酸腺苷酶、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛和一氧化氮等物質(zhì)的水平來保護腎臟[14]。而db/db小鼠血漿中甘氨酸含量明顯減少，說明腎臟已受到損傷。

TMAO一般作為腎小管受損的標(biāo)志物[15]，在本實驗中試驗組小鼠血漿內(nèi)TMAO含量顯著升高，提示著腎臟出現(xiàn)損傷，這一變化在db/db小鼠腎組織中同樣有所體現(xiàn)[16]。肌酸、肌酐含量的降低可能是由于發(fā)生糖尿病腎病時，由于高血壓血管緊張蛋白酶代謝紊亂而引起了腎小球濾過速率改變，進而造成腎皮層血流改變[17]。血漿中乙酸鹽含量降低，與Salek等[18]報道一致。磷酸膽堿和甘油磷酸膽堿含量降低與Chen等利用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)檢測的8周齡db/db小鼠肝臟內(nèi)的變化一致[19]。磷酸膽堿是屬于構(gòu)成細胞膜的主要成分，試驗組小鼠血漿中含量的降低也提示著腎損傷。用代謝組學(xué)手段對血漿中小分子代謝物進行分析為進一步研究糖尿病腎病提供了更全面的信息。

表1 db/db小鼠與db/m小鼠血漿中主要差異代謝物及譜峰歸屬

本文采用用基于核磁共振的代謝組學(xué)方法對db/db糖尿病腎病模型小鼠的血漿進行了研究。結(jié)果顯示，與對照組db/m小鼠相比，試驗組db/db小鼠血漿內(nèi)多種代謝物含量發(fā)生了變化，體現(xiàn)在一些已知的腎損傷的標(biāo)志物TMAO、肌酸等，同時發(fā)現(xiàn)亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸、甘氨酸等氨基酸含量降低，提示糖尿病腎病出現(xiàn)時，由于腎損傷而出現(xiàn)的腎小管重吸收能力下降，會導(dǎo)致氨基酸的流失，這些氨基酸將可能作為新的潛在代謝標(biāo)志物。除此之外，糖尿病腎病小鼠可能還存在著三羧酸循環(huán)受阻，即能量代謝紊亂。以上結(jié)果表明，代謝組學(xué)技術(shù)能夠更全面的反映生物體的代謝變化，幫助人們更好地了解生物體中各種復(fù)雜的代謝通路，這有可能成為一種輔助糖尿病腎病臨床診斷以及病理機制探討的重要手段。

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