不同培養(yǎng)基和促成熟組合對人外周血來源樹突狀細胞發(fā)育的影響

金 悅1,2,3 張 斌2,3▲ 陳 虎2,3▲

1.解放軍軍醫(yī)進修學院，北京 100853；2.軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院造血干細胞移植科，北京 100071；3.軍事醫(yī)學科學院細胞與基因治療中心，北京 100071

樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是目前公認的體內功能最強大的專職性抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC），它能激活靜止型T細胞，是啟動、調控、維持免疫反應的中心環(huán)節(jié)，并在腫瘤、器官移植、感染等領域顯示出免疫治療的有效性。但人體內大部分DC處于非成熟狀態(tài)，表達低水平的共刺激因子和黏附因子，體外激發(fā)同種混合淋巴細胞增殖反應的能力較低，成熟的DC表達高水平的共刺激因子和黏附因子，在成熟的過程中，由接觸抗原的外周組織遷移進入次級淋巴器官，與T細胞接觸并激發(fā)免疫應答。2011年，美國洛克菲勒大學教授、免疫學家Ralph MS因“發(fā)現樹突狀細胞及其在獲得性免疫中的作用”獲得諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。樹突狀細胞也因此再一次成為人們研究的焦點。DC在腫瘤、感染、器官移植等領域已顯示出其免疫治療的有效性及可行性，但體內DC數量極少，在外周血單個核細胞中所占比例低，故目前臨床所用DC多是采集DC前體細胞后，經體外培養(yǎng)得到成熟DC細胞[1-2]。然而，人的DC培養(yǎng)體系不同，體外得到的DC數量也不同，DC的功能也有較大差異，因此，本課題組對比兩種培養(yǎng)基和不同促成熟因子組合對人外周血來源DC發(fā)育的影響，旨在為優(yōu)化人外周血來源DC培養(yǎng)體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

淋巴細胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責任公司，臨床使用標準Cat LTS1077）；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（recombinant human GM-CSF，rhGM-CSF），重組人白細胞介素（recombinant human interleukin，rhIL）-4，重組人腫瘤壞死因子-α（rhTNF-α）購自美國PeproTech公司，重組人白細胞介素（recombinant human interleukin，rhIL）-1β，重組人白細胞介素（recombinant human interleukin，rhIL）-6購自美國 PeproTech 公司，前列腺素 E2（Prostaglandin E2，PGE2）購自美國Sigma公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液購自某公司，CellGro無血清樹突狀細胞培養(yǎng)基購自A公司，無血清培養(yǎng)基X-VIVO 15TM購自B公司，細胞因子定量檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自中國深圳達科為生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡（OLYMPUS）；流式細胞儀（FACS Calibur，BD 公司）；全自動酶標儀；電動移液器（Eppendorf）；6孔、12孔細胞培養(yǎng)板若干。 25、15、10 mL移液管若干。

1.2 人外周血來源DC的體外培養(yǎng)方法

1.2.1 人外周血單個核細胞的獲取

采集腫瘤患者靜脈外周血60 mL，肝素鈉抗凝（20 U/mL全血），生理鹽水等量稀釋。在處于正常工作狀態(tài)的生物安全柜中，將采血袋中血液分裝到兩個50 mL離心管中，用生理鹽水補足每管至40 mL。平衡后，以轉速2 000 r/min在20℃下離心8 min。將上述離心管中的血細胞與0.9%生理鹽水用30 mL生理鹽水懸起混勻后，緩慢加到含有15 mL室溫Ficoll的50 mL離心管中。平衡后，以轉速2 000 r/min在20℃下離心20 min（無離心剎車狀態(tài)）。離心完畢后，用10 mL移液管仔細小心吸取第2層白膜層細胞到新50 mL離心管中，每管中白膜層細胞8～15 mL。向上述離心管中加入0.9%生理鹽水至40 mL，以轉速1 800 r/min在20℃下離心8 min，棄上清后，加入2 mL 0.9%生理鹽水進行重懸。向上述細胞重懸后的離心管中加入0.9%生理鹽水至30mL，以轉速1600r/min在20℃下離心8 min，棄上清后，加入2 mL 0.9%生理鹽水進行重懸。向上述離心管中加入含0.9%生理鹽水至30 mL，以轉速1 400 r/min在20℃下離心8 min，棄上清后，加入2 mL無血清培養(yǎng)基進行重懸。需要注意的是，清洗PBMC白膜時，3次離心速度必須要梯度降低，以盡可能地除去血小板。末次離心后，吸去上清，加入RPMI 1640液重懸細胞，調整細胞密度為 3×106/mL， 分別加入 12 孔板中，1 mL/孔，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)2～4 h，輕輕洗出懸浮細胞（留作后用），貼壁細胞為單核細胞。

1.2.2 DCs的體外誘導

輕輕洗去完全貼壁4 h的單核細胞培養(yǎng)板中的RPMI 1640 液，分別加入含 GM-CSF（100 ng/mL）、IL-4（200 ng/mL）的CellGro和X-VIVO兩種不同培養(yǎng)基，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，第3天半量換液1次。培養(yǎng)第6天，向兩種培養(yǎng)基中加入兩種不同組合的促成熟因子，第一種組合為：TNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10 ng/mL）、IL-6（1 000 U/mL）、PGE2（10 ng/mL），簡稱雞尾酒組1，設兩個副孔。第二種組合為：TNF-α（10 ng/mL），簡稱TNF-α組，設兩個副孔。對照組不添加任何促成熟因子。將六組DC按表1編號。具體見表1。

表1 六組DC編號

1.2.2.1 DC的形態(tài)學觀察 用倒置顯微鏡每日觀察細胞生長情況及形態(tài)的變化情況，第6天和第8天用0.4%臺盼藍對三組DC進行染色，觀察細胞存活率。細胞的存活率計算公式：存活率=染色陰性細胞數/細胞總數×100%。

1.2.2.2 DC的表型分析 培養(yǎng)第8天，將六組DC收獲，分別用 4℃的 PBS洗滌兩次，重懸細胞數為 5×106/mL，加入Eppendor管中，每管200 μL，按照制造商說明的方法加入抗CD80、抗 CD83，置 4℃冰箱 30 min，然后用 4℃ PBS洗滌兩次除去游離熒光抗體，上機進行流式細胞表型分析。用對照組作陰性對照，用陽性細胞比例來表示DC表型和成熟度。

1.2.2.3 細胞因子檢測 培養(yǎng)第8天，采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）分別檢測六組DC上清液中IL-12p70、IL-10的含量，方法按照商家說明進行，建立標準曲線，每組3個復孔，每組試驗重復6次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 樹突狀細胞的培養(yǎng)形態(tài)

從倒置顯微鏡下觀察兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞形態(tài)可以看出，在培養(yǎng)初期X-VIVO培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC繁殖較快，但隨著培養(yǎng)時間的延長，CellGro培養(yǎng)的細胞繁殖情況也與XVIVO基本一致。觀察培養(yǎng)第6天和第8天的DC，可見兩種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的iDC和mDC都具備未成熟與成熟DC的典型鏡下特征：未成熟的細胞呈圓球狀，表面無明顯突起，而加入兩種促成熟因子組合的DC，則表現出成熟樹突狀細胞表面特有的明顯的不規(guī)則突起，但肉眼不能區(qū)分兩種組合對DC的促成熟能力（圖1）。經0.4%臺盼藍染發(fā)顯示細胞存活率均 ＞95%。

2.2 樹突狀細胞的表型分析

收集體外培養(yǎng)第8天的6組DC，經流式細胞儀檢測發(fā)現，未加入促成熟因子的對照組的細胞CD80和CD83的表達量都很低（圖2）；而無論是X-VIVO還是CellGro培養(yǎng)的DC，加入促成熟因子后，CD80和CD83的表達量明顯高于對照組，使用雞尾酒組促成熟的細胞CD80和CD83的表達均高于使用TNF-α組促成熟的細胞。X-VIVO雞尾酒組培養(yǎng)的DC，CD80（88.31±1.04）% ，CD83（43.66±0.87）% ，X-VIVO TNF-α 組培養(yǎng)的 DC，CD80（50.74±2.45）%，CD83（27.99±1.88）%， CellGro雞尾酒組培養(yǎng)的 DC，CD80（95.92±3.44）%，CD83（70.00±2.01）%，CellGro TNF-α 組培養(yǎng) 的 DC，CD80（77.35±1.08）%，CD83（50.42±1.80）%（圖3）。

2.3 樹突狀細胞的細胞因子水平表達情況

六組DC分泌IL-10和IL-12p70水平，具體見表2。

3 討論

圖1 倒置顯微鏡下兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)的DC（×40）

圖2 對照組CD80和CD83細胞表面標志表達量

表2 不同培養(yǎng)體系分泌細胞因子水平（±s，n=3）

表2 不同培養(yǎng)體系分泌細胞因子水平（±s，n=3）

注：與X-VIVO對照組比較，*P＜0.05

組別 表達水平（pg/mL）IL-10 IL-12p70 X-VIVO雞尾酒組X-VIVO TNF-α組X-VIVO對照組CellGro雞尾酒組CellGro TNF-α組CellGro對照組4.4±0.9 3.9±0.9 4.1±0.9 8.5±0.8 6.4±1.1 5.7±0.9 8.2±0.5*13.2±1.1*17.7±0.9 5.8±1.3 19.2±0.8 36.0±0.9

在過去的10年中，人們對DC免疫生物學及其功能調整的理解逐漸加強，導致了以DC為基礎的腫瘤疫苗的發(fā)展，繼而使人們不斷地尋找體外培養(yǎng)DC的更優(yōu)化條件和體系。本實驗設計的兩種培養(yǎng)基，均為無血清培養(yǎng)基，但由于培養(yǎng)基組成不同，可能具有不同的模擬體外的微環(huán)境，從而影響DC的功能和表型等特點。X-VIVO 15TM是調整優(yōu)化使之適合于無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周血及人類腫瘤中分離純化的CD3+細胞的增殖[3-4]。同時還用于維持人類單核細胞、巨噬細胞及細胞系、粒細胞和自然殺傷細胞（NK）的生長。而CellGro DC培養(yǎng)基用于單核細胞或來自于CD34+造血干細胞產生的樹突狀細胞的最優(yōu)化生長，不含生長因子、抗生素或未確定的添加劑，含人蛋白、重組人的胰島素和人的鐵傳遞蛋白的完全配方。本研究結果顯示，經過X-VIVO 15TM和CellGro培養(yǎng)基培養(yǎng)出的DC在細胞形態(tài)上幾乎無差別，但在細胞表型和細胞因子分泌上則有很多差異。顯然，在相同促成熟條件下，使用CellGro培養(yǎng)的DC的CD80、CD83均高于使用 X-VIVO培養(yǎng)的DC，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即說明前者的DC成熟度高于后者，這可能說明CellGro更適合于PBMC來源的DC的體外培養(yǎng)。早在1997年，Jonuleit等提出，應用雞尾酒組合促成熟的DC被人們稱為“標準DC”。他們證明這項混合物可以誘導DC的成熟，并且可以完全地取代Romani等之前提出的條件培養(yǎng)基。后有學者[5]證明了在細胞因子組合中添加PGE2（1 μg/mL）可以進一步增強DC傳代的產量、質量和遷移能力。本實驗中的結果顯示，在相同培養(yǎng)基條件下，雞尾酒組的DC的CD80、CD83均高于TNF-α組DC，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這說明，雞尾酒組促成熟效果優(yōu)于單純使用TNF-α，與Landi等[1]得出的結論是一致的。

筆者在檢測DC表型的基礎上，進一步對其作用機制進行了初步的探討。由于細胞因子在DC的分化與功能等方面都有十分重要的作用，因此，本研究使用ELISA的方法，收集各組不同培養(yǎng)體系的上清液，檢測細胞因子分泌情況。理論上來講，在遇到外來抗原，DC可分泌以IL-12和IFN-γ為主的細胞因子，介導Th1型免疫反應；對于自身抗原，部分其他功能的DC可通過分泌IL-10誘導調節(jié)性T細胞與Th2細胞介導免疫耐受[3]。本研究結果顯示，相同培養(yǎng)基條件下，雞尾酒組IL-12p70和IL-10普遍低于TNF-α組，這可能與PGE2有關，因為PGE2可增加DC的遷移能力，但是卻抑制IL-12p70和IL-10的分泌[4]，這是雞尾酒組用于DC促成熟方面的弊端，目前，有研究顯示，雞尾酒組合聯(lián)合應用TLR3配體polyⅠC和TLR7/8配體R848以及PGE2促成熟的DC可兼具高遷移能力和高產量的IL-12p705，還也可以在以后的試驗中設計加入TLR類配體來證實這一點。

目前DC的體外培養(yǎng)方法雖已基本滿足基礎研究的需要，但是應用于臨床治療還需要進一步研究，因此，建立一種合理的培養(yǎng)體系仍是今后研究的方向。

[1]LandiA，Babiuk LA，Drunen LH.Dendriticcellsmatured bya prostaglandin E2-containing cocktail can produce high levels of IL-12p70 and are more mature and Th1-biased than dendritic cells treated with TNF-alpha or LPS[J].Immunobiology，2011，216（6）：649-662.

[2]Johansson U，Walther JL，Hofmann A，et al.Dendritic cells are able to produce IL-12p70 after uptake of apoptotic cells[J].Immunobiology，2011，216（1-2）：251-255.

[3]Couper KN，Blount DG，Riley EM.IL-10：the master regulator of immunity to infection[J].J Immunol，2008，180（9）：5771-5777.

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