鑒定海參的斑點(diǎn)雜交法及其應(yīng)用＊

律迎春，段高飛，左 濤，徐 潔，李 晉，鄭 榮，唐慶娟，薛長(zhǎng)湖

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266003）

海 參 （sea cucumber，Phylum Echinodermata：Holothuroidea）是海洋中重要的食物和藥物資源，全球現(xiàn)存海參1 200多種，分屬于6目25科，其中具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的有40余種［1］。我國(guó)分布有140種海參，其中20余種具有食用價(jià)值［2］。海參具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、促進(jìn)造血功能、抗凝血和降血脂等生理功效［3］。其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受人們的青睞，近幾年國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上出現(xiàn)了即食海參、海參膠囊、海參酒等多種海參產(chǎn)品。在商業(yè)利益的驅(qū)動(dòng)下，海參市場(chǎng)上出現(xiàn)一些以假亂真、以次充好的現(xiàn)象，如何快速鑒定海參種類成為目前亟待解決的問(wèn)題。

傳統(tǒng)的海參鑒定方法主要是基于海參的外部形態(tài)和解剖特征［4］。市場(chǎng)上銷售的干海參種類繁多，經(jīng)過(guò)一系列加工后形態(tài)破壞嚴(yán)重，因此依靠海參外部形態(tài)鑒定難度較大，準(zhǔn)確度得不到保證。解剖特征主要指海參骨片的形態(tài)和呼吸樹(shù)的有無(wú)，海參含有的骨片種類較多，需要結(jié)合各類骨片的相對(duì)比例和同一類型骨片的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定［5］。廖玉麟［6］等曾對(duì)我國(guó)的134種海參進(jìn)行形態(tài)學(xué)的分類，并對(duì)國(guó)內(nèi)50多種海參骨片的組成特征進(jìn)行了觀察，認(rèn)為海參骨片是重要的分類依據(jù)。但是利用骨片進(jìn)行鑒定需要對(duì)每只海參的骨片類型和比例進(jìn)行辨認(rèn)和統(tǒng)計(jì)，技術(shù)要求比較高，需要專業(yè)人員鑒定，消費(fèi)者難以采用。并且該過(guò)程工作量非常大，耗時(shí)也比較長(zhǎng)，不能作為一種快速準(zhǔn)確的海參種類鑒定的方法。

分子生物學(xué)方法是近幾年逐漸發(fā)展起來(lái)的一種物種鑒定手段，在種類鑒定領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)方法通過(guò)特異性探針與目的核酸進(jìn)行雜交，從而檢測(cè)特定核酸序列，該方法已經(jīng)在疾病診斷等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用［7］。DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是通過(guò)對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。2003年，Herbert［8］最早提出在動(dòng)物界中COⅠ基因是合適的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因，可以有效的用于動(dòng)物物種的鑒定。律迎春等［9］前期構(gòu)建了海參的DNA條形碼，并初步驗(yàn)證了斑點(diǎn)雜交方法在海參種類鑒定中應(yīng)用的可行性。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，針對(duì)不同種類的海參，分別設(shè)計(jì)了種屬特異性探針進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，深入探討該方法的實(shí)際應(yīng)用情況。

1 材料與方法

1.1 材料

北大西洋瓜參 （Cucumaria frondosa），仿刺參（Apostichopus japonicus），加 州 紅 參 （Parastichopus californicus），梅花參（Thelenota ananas）均購(gòu)自青島海產(chǎn)品市場(chǎng)。海參樣品采用廖玉麟和Massion的方法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定確定海參種類［4，10］。

1.2 海參DNA的提取

干海參用無(wú)菌水泡發(fā)，取100mg肌肉柱，沖洗干凈，用濾紙吸干，切碎。采用CTAB法［11］提取4種海參的總DNA，無(wú)菌水溶解，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 海參線粒體COⅠ基因的擴(kuò)增

采用PCR技術(shù)對(duì)線粒體COⅠ基因序列片段進(jìn)行快速擴(kuò)增。引物序列［6］為：

擴(kuò)增長(zhǎng)度約為690bp。

反應(yīng)體系（50μL）為：MgCl2（25mmol／L）3μL，dNTPs（10mmol／L）1μL，2種引物各1μL（終濃度0.2μmol），TaqDNA聚合酶（寶生物工程有限公司，5U／μL）1μL，10×PCR Buffer 5μL以及模板 DNA 1μL，加水補(bǔ)足至50μL。

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5min；后經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：94℃50s，46℃1min，72℃1min；最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 斑點(diǎn)雜交鑒定海參種類

1.4.1 四種海參特異性探針的設(shè)計(jì) PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工生物工程有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行人工核對(duì)、校正。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證海參種類。采用 DNAMAN 6.0、DNAstar 6.1和MEGA 4.1軟件對(duì)4種海參的序列進(jìn)行比對(duì)分析，采用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)探針，5＇端進(jìn)行生物素標(biāo)記。由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2 斑點(diǎn)雜交 膜前處理：用鉛筆在硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane；NC membrane）上劃分（1×1）cm2的小格，UV照射30min，在2×SSC中浸泡10min，自然晾干；PCR產(chǎn)物于95℃熱處理10min后迅速冰浴冷卻，取3μLPCR產(chǎn)物點(diǎn)于小格中央，晾干后110℃烘烤45min。

雜交：50℃預(yù)雜交1h（雜交液：50%甲酰胺，0.5%BSA，1%SDS，0.5%polyvinylpyrrolidone，5×SSC）。加入含探針的雜交液中，55℃雜交2h。

洗滌、封阻、顯色：用2×SSC－0.1%SDS和0.5×SSC－0.1%SDS分別洗膜2次，最后PBS洗膜1次。洗滌后于37℃下封阻1h（3%BSA）。然后將膜轉(zhuǎn)入含1μg streptavidin－AP（VECTOR，USA）的PBS溶液中37℃處理1h后，用PBS反復(fù)沖洗，晾干。最后將膜轉(zhuǎn)入顯色液（BCIP／NBT的磷酸鹽溶液）中37℃避光顯色。洗滌，晾干并照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4.3 斑點(diǎn)雜交特異性 以4種海參DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，確定濃度，并調(diào)整到相同濃度。分別點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上，與4種探針雜交，檢驗(yàn)探針的特異性。

1.4.4 斑點(diǎn)雜交靈敏度 4種海參DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并調(diào)整到10 ng／3μL，倍 比 稀釋至 1ng／3μL，100pg／3μL 和10pg／3μL，分別點(diǎn)樣于硝酸纖維膜上，與特異性探針雜交，顯色后記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定斑點(diǎn)雜交的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 海參線粒體COⅠ基因的擴(kuò)增

以海參DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增COⅠ基因，瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到了約為690bp的目的片段（見(jiàn)圖1）。

圖1 4種海參PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 The amplification products of four sea cucumbers in agarose gel

2.2 探針的設(shè)計(jì)

為了保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中斑點(diǎn)雜交的雜交特異性和穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的探針的退火溫度（Tm）值應(yīng)該接近。本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)的4條探針Tm值均在（60±3）℃，探針信息見(jiàn)表1。

表1 探針序列及Tm值Table 1 Sequences and Tmof the probes

2.3 斑點(diǎn)雜交鑒定4種海參

2.3.1 斑點(diǎn)雜交特異性 以仿刺參、北大西洋瓜參、加州紅參和梅花參的DNA為模版，PCR擴(kuò)增COⅠ基因，紫外分光光度計(jì)測(cè)定并調(diào)整到相同濃度后，點(diǎn)樣于NC膜上，分別與4種探針雜交（見(jiàn)圖2）。結(jié)果顯示，A膜與仿刺參探針雜交，只有仿刺參的點(diǎn)樣位置出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)；說(shuō)明仿刺參探針有較高的特異性；B、C、D膜分別與北大西洋瓜參探針、加州紅參探針、梅花參探針雜交，也只有特異性的斑點(diǎn)出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究設(shè)計(jì)的4條探針均具有高度的特異性。

2.3.2 斑點(diǎn)雜交靈敏度 探針斑點(diǎn)雜交靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示4種海參點(diǎn)樣10ng、1ng、100pg樣品均出現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)，說(shuō)明該本實(shí)驗(yàn)建立的斑點(diǎn)雜交方法靈敏度可以達(dá)到100pg。

3 討論

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是根據(jù)DNA存在豐富的多態(tài)性而發(fā)展起來(lái)的，可直接反映生物個(gè)體在DNA水平上差異的一類新型的遺傳標(biāo)記技術(shù)，它是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記之后更為可靠的遺傳標(biāo)記技術(shù)，并且取得了快速的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)選擇海參線粒體DNA的COⅠ基因作為DNA分子標(biāo)記，線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單［12］、嚴(yán)格的母系遺傳［13］、無(wú)重組［14］、與核基因組無(wú)共同序列［15］、進(jìn)化速率快［16］、多拷貝［15］等特點(diǎn)。線粒體細(xì)胞色素c氧化 酶 亞 基 Ⅰ （Mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）是位于mtDNA的一段序列，由于存在顯著的序列變異而能有效地對(duì)動(dòng)物物種進(jìn)行鑒定，被認(rèn)為是一種合適的DNA分子標(biāo)記［17］。梁君妮等［18］采用PCR對(duì)多種海參的線粒體COⅠ序列進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序及比對(duì)，發(fā)現(xiàn)COⅠ片段可以用于海參種類的鑒定。PCR測(cè)序法雖然具有較高的靈敏度，但需經(jīng)過(guò)測(cè)序，周期長(zhǎng)，不便于快速鑒定和大規(guī)模推廣使用［19］。

核酸斑點(diǎn)雜交通過(guò)帶有標(biāo)記的特異性探針和核酸雜交后顯色進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果直觀，容易判斷。雖然斑點(diǎn)雜交靈敏度低于PCR等方法，由于其具有成本低廉、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、通量高等優(yōu)點(diǎn)，是目前分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一，已廣泛應(yīng)用于疾病診斷等領(lǐng)域［7］。王印庚等［20］利用地高辛標(biāo)記的特異性探針檢測(cè)刺參腐皮綜合征的病原菌，檢出限為6.25pg，具有較高靈敏度。本研究建立了斑點(diǎn)雜交方法用于鑒定4種海參的種類。實(shí)驗(yàn)中還選取了其它7種海參作為對(duì)照，檢測(cè)該方法的特異性。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)合成的4種探針具有很高的種屬特異性，靈敏度達(dá)到100pg。本研究提供了一種快速、簡(jiǎn)便、成本較低的海參種類鑒定方法，為進(jìn)一步建立以斑點(diǎn)雜交為基礎(chǔ)的基因芯片進(jìn)行海參種類鑒定奠定了理論基礎(chǔ)。由于斑點(diǎn)雜交方法不需要完整海參個(gè)體，因此可以應(yīng)用于海參的深加工產(chǎn)品（海參膠囊，海參粉劑，海參口服液等）的檢測(cè)。本研究將為海參制品的質(zhì)量監(jiān)督、控制提供方法支撐，具有顯著的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

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