中國南黃海滸苔種群世代結(jié)構(gòu)與生殖條件分析＊

王浩東，姚 雪，池 姍，趙 翠，金月梅，劉 翠，朱明壯，劉 濤＊＊

（中國海洋大學(xué)1.海洋生命學(xué)院；2.水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島266003）

滸苔（Ulva prolifera）屬于綠藻門（Chlorophyta）、石莼目（Ulvales）、石莼科（Ulvaceae）、石莼屬（Ulva），是世界范圍內(nèi)“綠潮”形成的主要種類之一。近年來這種因海水富營養(yǎng)化和氣候異常等因素引起的災(zāi)難性現(xiàn)象引起了廣泛的重視，產(chǎn)生了許多關(guān)于石莼屬物種的生長發(fā)育條件的研究，包括適宜其生長的溫度、鹽度、光強(qiáng)等生態(tài)因子的范圍［1－5］，CO2、N、Fe、Mn、P等營養(yǎng)元素對其生長的影響［6－8］，以及生活史的研究等［9－13］。

本實(shí)驗(yàn)首先研究了不同地區(qū)、不同季節(jié)滸苔樣品的世代結(jié)構(gòu)特征，探討了溫度、鹽度和光強(qiáng)等生態(tài)因子對其配子和孢子放散速度及放散量的影響，以期為探明綠潮暴發(fā)的機(jī)制提供科學(xué)參考。

表1 實(shí)驗(yàn)材料的采集地信息Table 1 Collection details of Ulva prolifera used in this study

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料采集于2009年江蘇省沿海，包括了11個站位的35份滸苔樣品，保存于中國海洋大學(xué)大型海藻種質(zhì)庫（樣品采集地分布見表1、圖1）。

圖1 實(shí)驗(yàn)材料的采集地Fig.1 Collection sites of Ulva proliferafrom the Yellow Sea，China

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)處理及群體放散測試 對表1中的群體樣品，在濃度為1%的KI－I2溶液中漂洗3～5s以殺死原生動物和附生雜藻，然后用經(jīng)煮沸的消毒海水沖洗2～3次，再放入500mL燒杯中，保鮮膜加蓋置于溫度18℃、光照強(qiáng)度3 000lx下保存3d，培養(yǎng)液為煮沸過的消毒海水。

在保存期間，對所有群體做放散測試，方法為：在每個群體中選擇10株以上的藻體，用吸水紙吸干，置于4℃、黑暗條件下做低溫干燥刺激放散，處理時間為5min。之后用一次性滴管在藻體中滴加常溫海水，使生殖細(xì)胞放散。1min后吸取包含生殖細(xì)胞的海水，滴加在潔凈的載玻片上，通以單側(cè)光照后，置于OLYMPUS－CX21顯微鏡10倍目鏡下觀察趨光性。滴加約等倍體積的20%KI－I2染液，100倍目鏡下觀察生殖細(xì)胞的鞭毛數(shù)目，每個群體統(tǒng)計(jì)20個以上的生殖細(xì)胞鞭毛數(shù)目，若觀察到的生殖細(xì)胞都為2鞭毛且具有正趨光性，則可認(rèn)為是配子體群體；若觀測到的生殖細(xì)胞都為4鞭毛且具有負(fù)趨光性，則可認(rèn)為是孢子體群體［14］；若2、4鞭毛相混雜且包含2種趨光性的生殖細(xì)胞，則認(rèn)為是孢子體與配子體混合的群體。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 經(jīng)初步鑒定為配子體世代／孢子體世代的材料，每個群體中隨機(jī)挑選生長狀態(tài)良好一致且在鏡檢中未發(fā)生放散的單株藻體，在溫度25℃，鹽度40，光照強(qiáng)度7 000lx的條件下，500mL燒杯保鮮膜加蓋預(yù)培養(yǎng)2d。孢子體和配子體分隔培養(yǎng)。

采用三因素三水平完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)方案，觀察環(huán)境因子對滸苔配子體世代和孢子體世代生殖的影響。溫度設(shè)置15、20和25℃3個梯度，鹽度設(shè)置10、35、40 3個梯度，光照強(qiáng)度設(shè)置3 000、5 000和7 000lx 3個梯度、單側(cè)光照，共27個溫度－鹽度－光強(qiáng)組合，配子體分別編號為G1～G27，孢子體分別編號為S1～S27。為防止同一群體內(nèi)出現(xiàn)不同世代藻體的混雜，之前孢子體和配子體各預(yù)培養(yǎng)了2倍數(shù)量的藻體。

1.2.3 顯微觀察 培養(yǎng)當(dāng)天，即可用顯微鏡進(jìn)行觀察。經(jīng)連續(xù)觀察，每株統(tǒng)計(jì)20個以上放散的生殖細(xì)胞的鞭毛數(shù)目，以確定不同采集地的樣品所處世代是否相同。挑選放散時間相近的不同藻株的配子，將其調(diào)整到相當(dāng)?shù)拿芏群筮M(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。待生殖細(xì)胞充分放散后，對藻體不同部位進(jìn)行顯微觀察，并用DP71顯微鏡數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照進(jìn)行排空率的統(tǒng)計(jì)（視野中已經(jīng)排空的細(xì)胞的數(shù)量占所有細(xì)胞的比例即為藻體的排空率），每株藻體取5個視野分別統(tǒng)計(jì)記錄，少量出現(xiàn)異常數(shù)值的藻體，進(jìn)行添加法補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進(jìn)行方差分析，再采用q測驗(yàn)分析試驗(yàn)結(jié)果均值的差異顯著性。

1.2.4 DNA含量測定 參照方宗熙等的方法制備?；ü谛≡侣荽置敢海?5］，并添加1.5%的纖維素酶和2mol／L葡萄糖制備為酶解液，在25℃黑暗條件下酶解3h，得到滸苔體細(xì)胞原生質(zhì)體，1 500g離心收集后用－20℃預(yù)冷的乙醇溶液固定（終濃度為70%），稀釋為（1～2）×105個／mL細(xì)胞懸液，4℃保存。采集滸苔放散的生殖細(xì)胞，用－20℃預(yù)冷的乙醇溶液固定（終濃度為70%），稀釋為（1～2）×105個／mL細(xì)胞懸液，4℃保存。

選取雞紅細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)參照細(xì)胞（DNA含量為2.5pg），1 500g離心收集后加入1mL PBS緩沖液重懸，后加入1mg／mL碘化丙啶（PI）染料50μL染色30min，用Beckman Coulter公司的FC500MPL型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析（根據(jù)葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度設(shè)門，以排除淀粉酶顆粒等雜質(zhì)干擾，再根據(jù)大小3～5μm設(shè)門進(jìn)行細(xì)胞類群的劃分）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)滸苔樣品的世代鑒定

2.1.1 放散生殖細(xì)胞統(tǒng)計(jì) 選取12個采集地的28份滸苔樣品的生殖細(xì)胞類型進(jìn)行鑒定（見表2），發(fā)現(xiàn)均存在處于孢子體和配子體世代的藻體。春季10個采集地的24份樣品中，13份為配子體世代，11份為孢子體世代。秋季2個采集地的4份樣品，其中2份為孢子體世代，另外2份為孢子體和配子體混雜樣品。

表2 不同地區(qū)滸苔樣品放散生殖細(xì)胞鞭毛數(shù)目的統(tǒng)計(jì)及生活史世代的推測Table 2 Number of thallus releasing each type of zoids of Ulva prolifera and presumed generation of life history for each collection site

2.1.2 體細(xì)胞及生殖細(xì)胞DNA含量測定結(jié)果 在研究的12份樣品中，9份鑒定為配子體（配子），2份為孢子體（見表3）。配子（n）及配子體細(xì)胞（n）DNA含量在0.118～0.287pg之間（見圖2），孢子體（2n）DNA含量為0.542pg。其中200910096樣品DNA含量為0.349pg，在所測配子體體細(xì)胞DNA含量和孢子體體細(xì)胞DNA含量之間，因此推測此群體為孢子體和配子體世代混雜群體。根據(jù)孢子體和配子體細(xì)胞不同DNA含量可以進(jìn)行滸苔不同世代的快速鑒定（見圖3）。

表3 滸苔體細(xì)胞及生殖細(xì)胞樣品DNA含量流式測定結(jié)果及生活史世代的推測Table 3 DNA contents for gamete and vegetative cells of Ulva prolifera detected by flow cytometry and presumed generation of life history

圖2 滸苔配子樣品流式圖Fig.2Histograms of fluorescence intensity in nuclei isolated from gametes of Ulva prolifera

2.2 環(huán)境因子對滸苔不同世代生殖發(fā)育的影響

2.2.1 不同環(huán)境因子對滸苔配子體世代生殖發(fā)育的影響 在27個溫度－鹽度－光強(qiáng)組合中（見表4），溫度25℃、鹽度40和光照7 000lx處理下培養(yǎng)48h后最早開始放散，其余處理組最晚放散時間為培養(yǎng)96h后。生殖放散首先從藻體的頂端開始，放散后藻體發(fā)白，隨著放散繼續(xù)進(jìn)行，慢慢地整個藻體都變?yōu)榘咨?。放散出的配子在水面上聚集在一起，培養(yǎng)液表層呈明顯的綠色，輕輕晃動燒杯后聚集的配子散開，靜置1h后重新在靠近光源一側(cè)聚集，具有正趨光性；同時，經(jīng)染色后在顯微鏡檢其具有2根頂生鞭毛。挑選采自同一地區(qū)的，配子同步放散的處理組，進(jìn)行了5組雜交實(shí)驗(yàn)，配子存在配對現(xiàn)象，但最終均未融合。連續(xù)培養(yǎng)一周后藻體基本放散完畢，但部分藻體內(nèi)配子未完全排空，統(tǒng)計(jì)藻體平均排空率在0.192～0.999之間。

圖3 滸苔孢子體體細(xì)胞樣品流式圖Fig.3Histograms of fluorescence intensity in nuclei isolated from protoplasts of Ulva prolifera

表4 溫度、鹽度和光強(qiáng)3個環(huán)境因子對滸苔配子體生殖的影響Table 4 Effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of gametophytes of Ulva prolifera

生態(tài)因子對滸苔配子放散實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度、鹽度對滸苔配子的放散都有極顯著影響，且鹽度的影響大于溫度，而光照強(qiáng)度對滸苔配子的放散沒有顯著影響（見表5）。3種生態(tài)因子中，不僅任意2個生態(tài)因子間的交互效應(yīng)都極顯著，而且3個生態(tài)因子之間的交互效應(yīng)也極顯著。之后對各因素的不同水平進(jìn)行q測驗(yàn)以分析其差異顯著性，結(jié)果顯示較高溫度（25℃）處理相對于稍低溫度（20℃）處理組對配子釋放量有極顯著影響；較低鹽度（10）處理相對于海水平均鹽度（35）和較高鹽度（40）處理對配子釋放量也有極顯著影響；在光強(qiáng)上，不同強(qiáng)度的光照處理（3 000、5 000和7 000lx）對配子釋放量的影響沒有顯著差別。

表5 溫度、鹽度和光強(qiáng)3個因子對滸苔配子體生殖影響的方差分析Table 5 Variance analysis of effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of gametophyte of Ulva prolifera

2.2.2 環(huán)境因子對滸苔孢子體世代生殖發(fā)育的影響

在27個溫度－鹽度－光強(qiáng)組合中（見表6），溫度25℃、鹽度40和光照7 000lx條件下培養(yǎng)24h后最早開始放散，其余處理組最晚放散時間為培養(yǎng)120h后。孢子放散首先從藻體的頂端開始，放散后藻體發(fā)白，隨著放散繼續(xù)進(jìn)行，慢慢地整個藻體都變?yōu)榘咨?。孢子未在培養(yǎng)液表層聚集，為負(fù)趨光性；同時，經(jīng)染色后在顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)其具有4根頂生鞭毛，且無融合現(xiàn)象。連續(xù)培養(yǎng)一周后孢子基本放散完畢，但部分藻體內(nèi)孢子未完全排空，統(tǒng)計(jì)藻體平均排空率在0.022～0.992之間。

表6 溫度、鹽度和光強(qiáng)3個環(huán)境因子對滸苔孢子體生殖的影響Table 6 Effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of sporophytes of Ulva prolifera

生態(tài)因子對滸苔孢子體排放孢子的影響結(jié)果（見表7）表明，溫度、鹽度對滸苔孢子的放散都有極顯著影響，且溫度的影響大于鹽度，而光照強(qiáng)度對滸苔孢子的放散沒有顯著影響。3種生態(tài)因子中，除溫度與光強(qiáng)的交互效應(yīng)為顯著外，其他任意2個生態(tài)因子間的交互效應(yīng)都極顯著，并且3個生態(tài)因子之間的交互效應(yīng)也極顯著。對各因素的不同水平進(jìn)行q測驗(yàn)以分析其差異顯著性，結(jié)果顯示25和20℃處理組相對低溫（15℃）處理對孢子釋放量有極顯著影響；高鹽度（40）處理相對于較低鹽度（10）處理、海水平均鹽度（35）處理對孢子釋放量有顯著影響；不同光照強(qiáng)度處理（3 000、5 000和7 000lx）對孢子釋放量的影響沒有顯著差別。

表7 溫度、鹽度和光強(qiáng)3個因子對滸苔孢子體生殖影響的方差分析Table 5 Variance analysis of effects of temperature，salinity and light intensity on the reproduction of sporophyte of Ulva prolifera

3 討論

3.1 滸苔群體世代結(jié)構(gòu)

滸苔樣品放散生殖細(xì)胞的鞭毛數(shù)和細(xì)胞DNA含量測定的結(jié)果均證實(shí)了在同一時間、同一地理區(qū)域，有不同世代的滸苔并存的現(xiàn)象，這在滸苔自然群體中尚屬于首次發(fā)現(xiàn)。Seibin等報(bào)道了在緣管滸苔（U.linza）中同一群體內(nèi)存在的孢子體與配子體混雜的情況［9］。而在本實(shí)驗(yàn)中，對同一采集地不同株藻體放散的配子進(jìn)行了融合實(shí)驗(yàn)，均未獲得合子，推測其原因，可能是該樣品的各個藻株均是同一親本單性生殖的后代，從而造成自交不親和。這進(jìn)一步顯示出滸苔生殖特性對于其世代混雜的貢獻(xiàn)，即在配子生殖過程中同時存在著配子單性生殖和配子融合生殖2個途徑，從而在群體的一次生殖過程中出現(xiàn)了配子體（n）和孢子體（2n）2種后代。

3.2 滸苔流式細(xì)胞法的世代鑒定

目前為止，在石莼科海藻世代鑒定方面，多數(shù)研究主要依靠生殖細(xì)胞鞭毛數(shù)量和趨光性來探討其所處世代。但在滸苔、緣管滸苔生長發(fā)育特性研究中，均發(fā)現(xiàn)了其未放散生殖細(xì)胞直接在藻體中發(fā)育或附生于原藻體表面生長的現(xiàn)象［16－17］，這對于滸苔世代鑒定存在較大的干擾。比較準(zhǔn)確地方法是進(jìn)行染色體制片，觀察其染色體數(shù)目，但這種方法存在著操作復(fù)雜、檢測效率低等問題。利用熒光染色進(jìn)行藻體細(xì)胞DNA含量檢測是一種比較簡便和快捷的世代鑒定方法。Kapraun等使用顯微分光光度法（染料為DAPI）測定了滸苔和緣管滸苔的單細(xì)胞DNA含量，前者約為1.10pg，后者約為0.6pg［18］。Gall等使用流式細(xì)胞法（染料為EB）測定了扁滸苔（U.compressa）原生質(zhì)體的DNA含量，大約為0.26pg［19］，Kagami等使用激光掃描細(xì)胞儀（染料為PI）測得的扁滸苔配子體DNA含量為0.28pg，并認(rèn)為使用配子測量得到的數(shù)據(jù)比使用從配子體提取的細(xì)胞核測量結(jié)果更加穩(wěn)定［20］。本實(shí)驗(yàn)使用流式細(xì)胞法（染料為PI）測得的滸苔配子體DNA含量為0.23pg，孢子體DNA含量為0.54pg。不同研究結(jié)果顯示出基因組DNA含量差異可能主要來自于檢測方法，顯微分光光度法分析中易受到細(xì)胞質(zhì)中色素體遮擋，干擾了熒光激發(fā)強(qiáng)度。利用細(xì)胞DNA含量進(jìn)行世代鑒定需保證供測試樣品的單細(xì)胞的完整性以及其活力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在保證沒有附生藻體的情況下，進(jìn)行單株藻體生殖細(xì)胞觀察可以準(zhǔn)確地進(jìn)行其世代的鑒定，染色體制片較細(xì)胞DNA含量測定而言仍是世代鑒定最為可靠的方法；同時，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行微小個體檢測中，也可獲得較為可靠的研究結(jié)果。

3.3 環(huán)境因子對滸苔不同世代生殖發(fā)育的影響

劉峰等認(rèn)為低鹽度（18）和提高溫度（15和18℃）都有利于黃海綠潮構(gòu)成種生殖細(xì)胞的形成，而低溫會抑制其生殖細(xì)胞的形成［7］。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，滸苔孢子體和配子體的生殖發(fā)育對溫度、鹽度存在著不同的反應(yīng)機(jī)制，鹽度對配子體發(fā)育的影響大于溫度，且較高溫度（25℃）處理和較低鹽度（10）處理對配子的放散有更大的促進(jìn)作用；溫度對孢子體發(fā)育的影響大于鹽度，且較高溫度（25℃）處理和較高鹽度（40）處理對孢子的放散有更大的促進(jìn)作用。而不同強(qiáng)度的光照處理（3 000、5 000和7 000lx）對配子和孢子的釋放量的影響沒有顯著差別。部分已報(bào)道的研究結(jié)果顯示高光強(qiáng)對孢子釋放的促進(jìn)作用明顯［1－3］，與本文研究結(jié)果不同，可能是與選取的實(shí)驗(yàn)材料生長階段有關(guān)，且沒有考慮到不同生態(tài)因子之間的交互作用。

溫度、鹽度對滸苔的配子體、孢子體的生殖發(fā)育都有極顯著的影響，同時又與光照強(qiáng)度對滸苔配子體、孢子體放散的影響存在交互效應(yīng)。本研究顯示，在2009年春季在江蘇省近海采樣的樣品中大部分是配子體，受溫度升高和降水增多的影響，促使其進(jìn)入有性生殖過程，這與夏初降雨后池塘發(fā)生滸苔增多的現(xiàn)象相一致。而在秋冬季節(jié)，春夏季萌發(fā)的孢子體隨著降水減少將促使其無性生殖進(jìn)入配子體世代。但在滸苔世代交替中，配子體世代同時存在配子融合生殖和配子單性生殖2種途徑，形成了孢子體和配子體世代并存的現(xiàn)象，其生殖條件適宜范圍擴(kuò)大，在同時受到溫度、降水和光照強(qiáng)度的交互影響下，將潛在地存在“機(jī)會窗”（The window of opportunity）事件［21］，在短時間內(nèi)集中生殖擴(kuò)散，導(dǎo)致其種群規(guī)模的爆發(fā)性增長，最終形成綠潮災(zāi)害。

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