山東北部沿海四角蛤蜊性腺發(fā)育年周期研究＊

柯巧珍，李 琪，閆紅偉，孔令鋒

（中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003）

四角蛤蜊（Mactra veneriformis Reeve 1854）廣泛分布于中國(guó)、韓國(guó)、日本沿海，營(yíng)埋棲生活，主要生活在潮間帶的中、低潮區(qū)及淺海的泥沙灘［1－2］。在中國(guó)，沿海群眾歷有食用四角蛤蜊的習(xí)慣，但關(guān)于它的研究報(bào)道很少，其生態(tài)、生理和生物量方面的數(shù)據(jù)也有限［3－6］。近年來，對(duì)于四角蛤蜊的過渡采捕已導(dǎo)致其資源量日漸衰退。為了逆轉(zhuǎn)這種日益減少的趨勢(shì)，一方面，需要根據(jù)四角蛤蜊的繁殖特征制定禁漁期以保護(hù)野生資源，另一方面，開發(fā)人工養(yǎng)殖技術(shù)也變得至關(guān)重要。

Chung等［2］研究了韓國(guó)群山沿海四角蛤蜊的繁殖周期，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)四角蛤蜊主要在溫度高于22℃的7、8月間產(chǎn)卵。多項(xiàng)研究表明，溫度和食物豐度的季節(jié)變化與雙殼貝類生長(zhǎng)和繁殖密切相關(guān)［7－8］。對(duì)于性腺發(fā)育周期的研究是雙殼貝類人工育苗成功的基礎(chǔ)［9－10］。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者對(duì)四角蛤蜊的人工育苗進(jìn)行了初步研究［11－12］，但仍未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

本文結(jié)合采樣海區(qū)環(huán)境因子的周年變化情況，對(duì)山東無棣縣馬山子海區(qū)四角蛤蜊的繁殖周期進(jìn)行了研究，其主要目的在于：（1）描述配子發(fā)生周年變化的組織學(xué)特征；（2）確定該地區(qū)四角蛤蜊的配子發(fā)生期及產(chǎn)卵季節(jié)；（3）從定性和定量（條件指數(shù)、卵徑）兩方面探討繁殖周期與環(huán)境因子間可能存在的關(guān)系。該研究的開展不僅為判斷四角蛤蜊人工育苗的最適時(shí)機(jī)提供科學(xué)依據(jù)，也為其野生資源的管理和保護(hù)提供重要的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 采樣海區(qū)

實(shí)驗(yàn)所用樣品采自山東省無棣縣馬山子海區(qū)（38°09′N～38°13′N，117°58′E～118°12′E），地處黃河三角洲，瀕臨渤海，水生生物資源豐富。分別用水銀溫度計(jì)和便攜式折射計(jì)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定取樣海區(qū)海水的溫度和鹽度，同時(shí)采集采樣地海水樣品，避光保存，與貝類樣品一同運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，采用戴玉蓉等［13］的方法測(cè)定葉綠素a含量。

1.2 樣品采集

2007－04～2008－03，每月采集1次，每次隨機(jī)采集100個(gè)個(gè)體，將鮮活樣品置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室以備組織學(xué)分析。全年所采樣品生物學(xué)測(cè)量的平均結(jié)果如下：殼長(zhǎng)（3.31±0.35）cm，殼高（3.00±0.28）cm，軟體部鮮質(zhì)量（2.51±0.61）g。

1.3 條件指數(shù)

每月取5個(gè)四角蛤蜊個(gè)體，解剖，將軟體部與殼分離，在105℃烘箱中烘干至恒重，分別稱取軟體部干重和殼干重，計(jì)算條件指數(shù)。

條件指數(shù)＝（軟體部干重／殼干重）×100［14］

1.4 組織學(xué)分析

1.4.1 組織學(xué)切片 每個(gè)月取40～50個(gè)四角蛤蜊個(gè)體做組織學(xué)切片，觀察，以確定樣品的性腺發(fā)育程度及性別。將樣品解剖，觀察并切取5mm厚的性腺－內(nèi)臟團(tuán)小塊于Bouin's液中固定24h；然后轉(zhuǎn)移到70%酒精中儲(chǔ)存。制作切片時(shí)，將樣品做以下處理：梯度酒精脫水；石蠟滲透，包埋；常規(guī)組織學(xué)切片（5～6μm）；愛氏蘇木精－曙紅（H－E）染色；中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察每張切片，辨別雌雄并判斷各樣品的性腺發(fā)育程度。

1.4.2 卵母細(xì)胞和卵子直徑 將目微尺安裝到Olympus顯微鏡目鏡中，經(jīng)臺(tái)微尺（×400）校對(duì)后，測(cè)量組織學(xué)切片上卵子的直徑。每個(gè)月隨機(jī)選取5～8張雌性個(gè)體切片，每個(gè)個(gè)體至少測(cè)量100個(gè)清晰可見的卵子的直徑（穿過核仁的最長(zhǎng)軸）。根據(jù)Grant等［15］推薦的標(biāo)準(zhǔn)，未對(duì)卵子稀少和廣泛處于吞噬作用的個(gè)體進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件處理。用單因素方差分析（ANOVA，SNK）對(duì)條件指數(shù)月間差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)?？ǚ剑é?）檢驗(yàn)用于分析性比。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境因子的季節(jié)變化

圖1顯示了采樣海區(qū)海水的溫度、鹽度和葉綠素a含量的周年變化。如圖所示，水溫呈明顯的季節(jié)變化，4月（14.5℃）后，隨著夏季的到來，水溫持續(xù)上升，8月呈現(xiàn)最高值（30.0℃），9月～次年2月，水溫不斷下降，2月份降至最低（2.0℃）。

鹽度在31.0～34.1之間浮動(dòng)，10月～次年1月，鹽度均高于33，峰值出現(xiàn)在11月；夏季受雨季影響，6月和9月鹽度明顯降低，分別為31.0和31.4；冬季，鹽度隨著水溫的下降而降低。

葉綠素a含量亦呈季節(jié)性的變化，春季逐漸上升，夏季高溫期有所下降，9月達(dá)最高值（24.35μg／L），隨后下降，冬季處于全年最低水平（低于3.10μg／L）。

圖1 取樣海區(qū)水溫、鹽度和葉綠素a含量的周年變化Fig.1 Monthly variations in water temperature，salinity and chlorophyll ain the survey area

2.2 條件指數(shù)

隨著配子發(fā)育的進(jìn)行，4～5月間，條件指數(shù)顯著下降（見圖2）。然后，維持相對(duì)穩(wěn)定，直至大量成熟配子的排放，8～9月，條件指數(shù)明顯降低，10月降至全年最低3.95。耗盡期和休止期（10月至次年1月）則逐漸上升，1月出現(xiàn)峰值11.95；2月，條件指數(shù)隨配子發(fā)生的開始而減小。如圖2所示，除9月與2月外，條件指數(shù)的變化趨勢(shì)與軟體干重大致相同，這與該月殼的加速生長(zhǎng)有關(guān)。

圖2 四角蛤蜊殼干重、軟體干重及條件指數(shù)的周年變化fig.2 Monthly values of dry shell weight，dry flesh weight，and the condition index（CI）of the surf clam M.veneriformis

2.3 繁殖周期

2.3.1 性腺發(fā)育周期 參考Drummond等［16］對(duì)性腺發(fā)育各期特點(diǎn)的描述，將四角蛤蜊性腺發(fā)育過程分為6期（見圖3，4）：0期 （休止期）性腺主要由結(jié)締組織組成，雌雄不可辨別。

Ⅰ期 （形成期）性腺開始增殖；雌性濾泡壁上出現(xiàn)越來越多可辨別的卵，卵很小，濾泡腔中沒有游離的卵（圖3－A）。雄性濾泡壁上形成多層精原細(xì)胞，數(shù)量逐漸增加并且逐漸有精母細(xì)胞產(chǎn)生，無精細(xì)胞或精子（圖4－A）。

Ⅱ期 （增殖期）雌性濾泡腔中出現(xiàn)成熟卵子，但數(shù)量少于全部卵的一半，多數(shù)具短柄附著于濾泡壁上（圖3－B）。雄性濾泡中同時(shí)存在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子；在發(fā)育較慢的個(gè)體，沒有占主導(dǎo)地位的細(xì)胞類型（圖4－B）；進(jìn)一步發(fā)育的個(gè)體，濾泡中則主要充滿精細(xì)胞和精子（圖4－C）。

Ⅲ期 （成熟期）性腺體積增大；雌性濾泡腔內(nèi)充滿大量成熟卵子，相互擠壓，卵子呈多邊形，濾泡壁?。▓D3－C）。雄性濾泡主要由成熟精子組成，尾部指向?yàn)V泡腔中央，呈輻射帶狀；個(gè)體成熟度越高，精子輻射帶狀區(qū)域越接近濾泡壁（圖4－D）。

Ⅳ期 （排放期）雌性濾泡內(nèi)游離卵子的數(shù)量減少（圖3－D），有些濾泡內(nèi)的卵子全部排空，濾泡壁破裂（圖3－E）。雄性濾泡中，螺旋狀精子占了非常大的比例，一些濾泡由于成熟配子的排放而出現(xiàn)空腔（圖4－E）。

Ⅴ期 （耗盡期）濾泡破裂、分散，相對(duì)較空，發(fā)生吞噬作用。雌性僅觀察到一些殘留卵子，大部分處于重吸收階段（圖3－F）。雄性殘留少量精子，且處于重吸收階段（圖4－F）。

2.3.2 性腺發(fā)育分期 圖5顯示了雌雄四角蛤蜊各發(fā)育期所占比例的月變化。性腺發(fā)生開始于12月～次年1月間。前3個(gè)月的切片觀察結(jié)果表明，4～6月大部分個(gè)體（雌：91.3%；雄：97.0%）處于Ⅱ期（增殖期），每個(gè)月均有少數(shù)個(gè)體發(fā)育成熟。成熟期主要出現(xiàn)在7月（雌：68.3%；雄：33.3%），同時(shí)，本月也分別有22.2 %和31.3%的雌雄個(gè)體處于排放期。7、8月雄性處于增殖期的比例明顯高于雌性，12月雄性處于配子發(fā)生期的比例低于雌性，由此推測(cè)雄性的性腺發(fā)育可能略滯后于雌性。

2.3.3 性比 周年共采集1 161個(gè)四角蛤蜊1齡個(gè)體，其中49.0%為雌性，43.1%為雄性，7.9%因性腺未分化而分辨不出雌雄，未發(fā)現(xiàn)雌雄同體現(xiàn)象。如圖6所示，雌雄不可分辨的樣品主要出現(xiàn)在休止期（10～12月）。雌雄比例為1.138∶1，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，該比例與期望比值（1雌∶1雄）間存在顯著差異（χ2＝4.454；df＝1；P＜0.05），雌性多于雄性。

2.3.4 卵徑 隨著配子發(fā)育，卵徑不斷增大（見圖7），6、7月達(dá)最大，平均值分別為40.65和40.97μm。排放期（8、9月）則有所下降。10～12月大部分個(gè)體處于耗盡期和休止期，無法統(tǒng)計(jì)平均卵徑。

圖7 四角蛤蜊卵母細(xì)胞直徑月平均值的周年變化Fig.7 Monthly fluctuation in mean oocyte diameter of M.veneriformis

3 討論

為了有效保護(hù)貝類野生資源，并對(duì)其進(jìn)行養(yǎng)殖開發(fā)，近年來，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者運(yùn)用形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方法研究了眾多貝類，尤其是海洋經(jīng)濟(jì)貝類的繁殖生物學(xué)特點(diǎn)［9，17－18］。這些研究的開展對(duì)于揭示其生活史具有重要意義。繁殖期被確定，針對(duì)不同地區(qū)特定種類的禁漁期的設(shè)定也將有據(jù)可循［2，19］。

3.1 繁殖周期

貝類確切的產(chǎn)卵次數(shù)難以精確計(jì)算，往往只能界定一年中主要的產(chǎn)卵高峰期［20］。四角蛤蜊性腺發(fā)育的組織學(xué)周年觀察結(jié)果以及卵徑的月變化規(guī)律表明本實(shí)驗(yàn)所用四角蛤蜊全年只有1個(gè)產(chǎn)卵季節(jié)，發(fā)生在7～9月。這與Chung等［2］報(bào)道韓國(guó)群山沿海四角蛤蜊的產(chǎn)卵次數(shù)一致，其主要產(chǎn)卵季節(jié)發(fā)生在7～8月。但I(xiàn)watav［21］和 Oshima等［22］研究發(fā)現(xiàn)東京灣四角蛤蜊一年中有2個(gè)產(chǎn)卵期，分別為4～7月和9～10月上旬。本實(shí)驗(yàn)中，組織學(xué)觀察表明，四角蛤蜊的卵巢和精巢基本同步發(fā)育成熟，兩性配子同時(shí)排放，9月份大部分均已排盡。貝類生殖成功的重要基礎(chǔ)是兩性性腺的同步發(fā)育，精子和卵子同時(shí)排放會(huì)增加受精的可能性［23］。四角蛤蜊兩性配子均在8月集中排放，這為四角蛤蜊人工育苗過程中人工授精的可操作性提供了理論依據(jù)。

在雙殼貝類繁殖生物學(xué)研究中，條件指數(shù)常被用于判定貝類的成熟度。Kang等［24］和Drummond等［16］分別在長(zhǎng)牡蠣（Crassostrea gigas）和菲律賓蛤子（Ruditapes philippinarum）中，發(fā)現(xiàn)條件指數(shù)與性腺發(fā)育密切相關(guān)，在性成熟過程中增大，排放期及排放后期減小。本實(shí)驗(yàn)中，條件指數(shù)在配子發(fā)生初期略有降低，性成熟過程中保持相對(duì)穩(wěn)定，產(chǎn)卵后顯著減??；耗盡期逐漸上升，顯示出一個(gè)快速恢復(fù)期，1月達(dá)全年最高。同時(shí)，1月也正是性腺形成期，為性腺發(fā)育、成熟提供物質(zhì)基礎(chǔ)和能量來源。

本實(shí)驗(yàn)中，卵徑的變化情況很好地反映了四角蛤蜊的配子發(fā)育周期。配子發(fā)育過程中，卵徑逐漸增大，產(chǎn)卵前達(dá)到最大［20］。Lango－Reynoso等［25］和Joaquim等［9］分別用卵徑來描述長(zhǎng)牡蠣和堅(jiān)固馬珂蛤（Spisula solida）的性腺成熟度。本研究發(fā)現(xiàn)卵徑的變化從形成期、增殖期到成熟期（1～7月）逐漸增大，進(jìn)入成熟期相對(duì)穩(wěn)定（標(biāo)準(zhǔn)差最?。S著大部分飽滿、成熟的卵子的排放，卵徑減小，耗盡期殘留在濾泡中未排放的卵子逐漸溶解，被重吸收［26］。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得四角蛤蜊成熟卵子的直徑為36～45μm，排放中的卵子直徑為40～50μm，略小于韓國(guó)群山地區(qū)四角蛤蜊的卵子直徑，其值分別為50～65μm和65～70μm［2］。

四角蛤蜊是雌雄異體貝類，研究結(jié)果顯示山東無棣縣馬山子海區(qū)雌雄四角蛤蜊在數(shù)量上存在顯著差異，雌性多于雄性。這與Chung等［2］的研究結(jié)果有所不同，在韓國(guó)群山地區(qū)四角蛤蜊雌雄個(gè)體數(shù)量不存在顯著差異（雌雄比為1.046∶1）。此種差別可能是由于地理位置和環(huán)境條件不同引起的，Lango－Reynoso等［25］研究表明溫度和食物供給是長(zhǎng)牡蠣性別變化過程中的決定性因素。

3.2 繁殖周期與環(huán)境因子的關(guān)系

雙殼貝類的繁殖活動(dòng)受外部因素（如溫度、鹽度、光照和食物的豐歉度等）和內(nèi)部因素（內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等）綜合作用的影響［27－28］。適宜的外部環(huán)境是貝類性成熟、配子排放和幼蟲生長(zhǎng)的前提條件。Mann［29］報(bào)道英國(guó)的長(zhǎng)牡蠣，由于水溫很少超過18℃，通常性腺能夠發(fā)育成熟，但從不產(chǎn)卵，因此，他提出長(zhǎng)牡蠣的產(chǎn)卵也需要最低溫度，即性腺成熟的貝類需要在一定的溫度條件下才能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)卵。Park等［30］的研究結(jié)果表明環(huán)境中充足的食物和其他理化因子可控制菲律賓蛤仔的產(chǎn)卵節(jié)奏。本研究中，四角蛤蜊配子發(fā)生開始于水溫最低的冬季，此時(shí)葉綠素含量也最低；成熟配子排放期間，水溫與葉綠素a含量均為全年最高水平；9月大部分成熟精卵都已排放，此時(shí)水溫為21℃，浮游植物含量最豐富，這樣的環(huán)境條件有利于幼蟲的存活和生長(zhǎng)；隨后，溫度和食物量同時(shí)迅速下降，四角蛤蜊進(jìn)入恢復(fù)期，為下一次繁殖活動(dòng)準(zhǔn)備物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。由此可見，適宜的溫度和充足的食物是四角蛤蜊進(jìn)行繁殖活動(dòng)必要條件。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了一些有趣的現(xiàn)象，葉綠素a含量在6和9月出現(xiàn)2個(gè)峰值，與之相對(duì)應(yīng)的鹽度則出現(xiàn)峰谷；同時(shí)，這2個(gè)月的水溫十分接近，分別為22和21℃。6月有7.4%個(gè)體性腺已發(fā)育成熟，群體即將進(jìn)入成熟期；9月則有58.0%個(gè)體處于耗盡期，群體即將結(jié)束排放期。

綜上所述，山東無棣縣馬山子海區(qū)四角蛤蜊的繁殖周期分為2個(gè)明顯的階段：活躍期（4～9月）和相對(duì)靜止期（10月～次年3月）。主要產(chǎn)卵期為7～9月，其繁殖活動(dòng)與溫度、食物豐歉度等環(huán)境因子密切相關(guān)。條件指數(shù)和卵母細(xì)胞直徑可作為判斷性腺成熟度的良好指標(biāo)。本研究所獲得的數(shù)據(jù)為黃河三角洲地區(qū)四角蛤蜊種群資源的管理保護(hù)和四角蛤蜊工廠化苗種生產(chǎn)條件的優(yōu)化提供了理論基礎(chǔ)。

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