海水淹溺型急性肺損傷早期肺組織核因子-κB及相關細胞因子的動態(tài)變化

芮 萌，王 津，寧浩勇，張新紅，王大鵬，段蘊鈾

海水淹溺型急性肺損傷(seawater drowninginduced acute lung injury，SWD-ALI)是 ALI的一個特殊類型，由于海水高滲、偏堿等特性，使SWD-ALI具有病情重、變化快、救治難度大的特點，并成為海水淹溺主要死亡原因。與其他直接損傷因素一樣，淹溺導致海水吸入不僅會直接損傷肺實質細胞，而且還會通過激活急性炎癥反應，引起肺局部甚至全身炎癥反應綜合征，后者更是進一步成為導致ALI多種病理過程的主要因素。已有資料顯示，炎癥反應關鍵性控制點可能是位于胞漿中的核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，其作用猶如核內炎癥介質基因轉錄的啟動開關[1]，調節(jié)多種參與炎癥免疫反應的細胞因子、炎癥介質、黏附分子及蛋白酶類的基因轉錄，以控制它們的生物合成，但NF-κB活化在SWD-ALI發(fā)生、發(fā)展中的作用鮮見報道。為此，我們通過建立兔SWD-ALI模型，借助非放射性凝膠遷移實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)等方法，觀察肺組織 NF-κB活性及相關細胞因子在SWD-ALI發(fā)病過程中的動態(tài)變化，為SWD-ALI發(fā)病機制的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 選用健康新西蘭兔(購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，普通級，合格證號:SCXK2京2200220005)，雌雄不拘，體質量(2.20±0.25)kg。將實驗動物用隨機數(shù)字表法分為對照組(作為0 h基線值，即0h組)和海水灌注1 h(S1h)組、3 h(S3h)組、6 h(S6h)組、12 h(S12h)組、24 h(S24h)組(分別于海水灌注后 1、3、6、12、24 h 處死動物，檢測相關指標)。

1.2 動物模型制備和處理 動物模型制備參照文獻[2-3]。新西蘭兔經(jīng)速眠新和氯胺酮(1∶1)1 ml/kg肌內注射麻醉(后續(xù)實驗中按需給予1∶1速眠新和氯胺酮維持動物麻醉狀態(tài))，仰臥固定于動物手術臺。頸總動脈插管，連接三通，用于監(jiān)測血壓、心率、呼吸，給藥及獲得血標本。氣管切開，插入“Y”型玻璃套管。海水灌注組通過“Y”型玻璃套管，注入2 ml/kg的配方海水[2]，5 min內灌完，呼吸空氣，于灌注后0.5 h開始間斷檢測動脈血氣，根據(jù)動脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)和吸入氧濃度(forced inspiratory oxygen，F(xiàn)iO2)結果計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)=PaO2/0.21，以200≤PaO2/FiO2≤300且持續(xù)1 h以上作為模型制備成功的標準。按照分組分別于灌注后相應時間點抽血處死;對照組完成手術操作，不灌注液體，直接抽血處死。

1.3 標本采集 各組動物處死前抽血查總蛋白(total protein，TP)，隨后迅速開胸、夾閉氣管取全肺。肺組織處理:①取右上、中肺稱濕重(wet weight，W)，置于80℃烘箱內干燥72 h至恒重，稱肺干重(dry weight，D)，計算肺濕干重比值(W/D)。②取右下肺作肺泡灌洗，用10 ml生理鹽水分2次進行灌洗，灌洗液回收量在80%以上，離心，上清液檢測TP。計算肺通透指數(shù)(lung permeability index，LPI)=灌洗液TP/血清TP。③在左下肺相應部位分別取2份肺組織;1份用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木素和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，另外1份－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞因子濃度測定 取凍存肺組織200 mg左右，在體積總量為組織重量9倍的預冷生理鹽水中，研磨制備組織均漿。采用雙抗夾心ELISA法測定肺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-1β、IL-10等細胞因子濃度。操作按試劑盒(Rapidbio公司，美國)說明書步驟進行。

1.5 肺組織核蛋白提取和NF-κB活性測定 采用非放射性EMSA。取凍存肺組織300 mg左右，按說明書步驟抽提核蛋白(Viagene公司，美國)，測定核蛋白濃度(碧云天生物公司)。取5 μg核蛋白與400 fmol(1 fmol=10－15mol=10－3pmol)生物素雙標NF-κB探針室溫孵育20 min，6.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過電轉移法將DNA-蛋白復合物轉移到結合膜上，紫外燈下交聯(lián)固定10 min，室溫封閉30 min，與新配制的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)反應液室溫孵育20 min，洗滌平衡后，將化學發(fā)光試劑加于結合膜表面，立即以Cool Imager(Viagene公司，美國)進行化學發(fā)光數(shù)字成像。以積分灰度值表示NF-κB活性。Bio-NF-κB探針序列為5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'。Cold-NF-κB探針序列同前。陽性對照為THP-1細胞經(jīng)過TNF-α刺激后得到的NF-κB核轉運陽性物質。

1.6 肺組織病理觀察 肺損傷病理評分(lung pathologic score，LPS)參照有關資料[3]進行，每組取6張切片，每張切片取5個視野，根據(jù)毛細血管淤血、肺泡腔纖維蛋白滲出、中性粒細胞滲出、肺泡間隔增寬等項目的得分，將每個視野各項積分相加，將等級資料轉換為計量資料，分析判斷肺損傷程度。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。對不同實驗組在各個時間點各項數(shù)據(jù)的比較均采用重復測量資料的方差分析，若有差異，則采用SNK-q法進一步進行兩兩比較;對同一組處理后各時間點與處理前的比較采用Dunnett-t檢驗。NF-κB與各指標相關性分析采用直線相關完成。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PaO2/FiO2的變化 海水灌注后 0.5、1、2、3、6 h PaO2/FiO2依次為(203.8±37.8)、(248.7±67.0)、(253.2 ±73.6)、(287.8 ±14.0)、(308.2 ±61.0)mmHg，與對照組(422.8±42.6)mmHg比差異顯著(P ＜0.01)。0.5、1、2、3 h 的 PaO2/FiO2均＞200 mmHg且 ＜300 mmHg，表明 SWD-ALI模型制備成功。

2.2 肺組織病理改變 肺大體標本以S3h組淤血水腫最嚴重，呈暗紅色，體積最大，與肺損傷指標的變化大體一致。HE染色顯示對照組肺泡結構清晰、擴張均勻，肺泡壁薄，肺間質未見明顯水腫、出血和炎性細胞浸潤。S1h組以肺間質淤血最明顯，S3h組肺間質淤血及炎癥細胞浸潤均較顯著，S6h、S12h組以炎癥細胞浸潤最突出;肺泡間隔寬度、肺泡腔塌陷或擴張范圍和程度，隨時間延長而逐漸加重，S12h組肺泡隔明顯增寬(不均勻)，S24h組大部分區(qū)域已失去正常肺泡結構(圖1)。各海水灌注組LPS與對照組比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，以S6h組LPS最高，6 h后各組無統(tǒng)計學差異(表1)。

圖1 海水灌注后各時間點肺組織HE染色(×100)

表1 各組肺病理評分、W/D和肺通透指數(shù)的動態(tài)變化

2.3 肺損傷指標的變化 由表1可見，與對照組相比，各海水灌注組肺通透指數(shù)顯著增高(P＜0.05)，并以S6h組數(shù)值最高，但與S12h組、S24h組比較無差異。W/D于3 h達高峰，6 h有所下降，但仍明顯高于對照組(P＜0.01)，S12h組、S24h組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.4 肺組織 TNF-α、IL-1β、IL-10變化 與對照組相比，海水組各時間點肺組織 TNF-α、IL-1β、IL-10均顯著增高(P＜0.05)，并以S6h組數(shù)值最高(圖2)。

圖2 兔SWD-ALI時肺組織細胞因子的動態(tài)變化

2.5 肺組織NF-κB DNA結合活性的變化 海水灌注后1 h肺組織核提取物NF-κB DNA復合物電泳圖與對照組相比有所增強，3～6 h達高峰;12～24 h有所減弱，但仍明顯強于對照組;同一時間點積分灰度值亦相應地高于對照組(P＜0.05，圖3)。

圖3 各組NF-κB DNA復合物EMSA電泳條帶及積分灰度值

2.6 相關性分析 0～6 h時間段內，NF-κB活性與TNF-α、IL-1β、IL-10 及 LPS 正相關，相關系數(shù) r分別為0.971、0.981、0.987、0.967(P ＜ 0.05)。0 ～24 h時間段內，NF-κB活性僅與肺組織IL-1β、IL-10保持相關性，r分別為0.827、0.816(P ＜ 0.05)。TNF-α、IL-1β、IL-10 與 LPS 正相關，r分別為0.900、0.847、0.904(P ＜0.05)。TNF-α、IL-1β、IL-10 與 LPI的相關系數(shù)分別為0.833、0.828、0.851(P ＜0.05)。

3 討論

肺是淹溺后受損的主要器官。已有學者報道吸入1～3 ml/kg的液體就足以使人肺氣體交換功能產(chǎn)生顯著障礙，肺順應性降低10%～40%[4]。為此本實驗選用2 ml/kg體質量的液體量制備兔SWDALI模型。灌入海水后，實驗動物氧合指數(shù)0.5～3 h均在200～300 mmHg之間，直至6 h才超過300 mmHg;肺濕干重比值明顯高于對照組;肺通透指數(shù)1 h時已顯著增高，6 h后基本維持在高峰水平，提示肺泡毛細血管通透性的增加持續(xù)存在。病理學檢查可見炎癥細胞浸潤、肺泡水腫、肺間質淤血增寬等ALI征象，均提示SWD-ALI模型制備成功。

肺內過度性、失控性炎癥反應是各種致病因素導致ALI的根本原因，基因調控在炎癥反應發(fā)生、發(fā)展中的地位日益受到重視，其中NF-κB被證實具有關鍵作用。NF-κB屬于Rel家族，幾乎存在于所有真核細胞，典型組成為p50/p65異源二聚體，通常與其特定抑制蛋白IκB耦聯(lián)，以無活性形式存在于胞漿內。經(jīng)典的 NF-κB活化途徑聚焦于 IκB激酶(IκB kinase，IKK)復合體，各種刺激信號借助受體將信號傳遞至胞漿，通過激活IKK，磷酸化IκB，解離 NF-κB，并迅速觸發(fā)泛素-蛋白酶體系降解 IκB。游離的NF-κB二聚體因暴露核定向信號而活化，移入核內與靶基因啟動子或增強子上的κB位點發(fā)生特異性結合，并促使基因轉錄[5-8]。本實驗中，海水灌注后1 h NF-κB含量和活性已顯著增高，3 h活化的NF-κB就已增加了2.5倍(107.82/42.65);當肺泡毛細血管通透性進行性增加，肺損傷進一步加重時，NF-κB轉錄活性增加的倍數(shù)也上升到2.9(6 h，125.34/42.65)，在肺損傷進行性加重至高峰過程中，NF-κB活性亦進行性升高，兩者之間顯著相關。提示SWD-ALI早期NF-κB激活參與了肺損傷發(fā)生、發(fā)展的進程。12～24 h NF-κB活性仍明顯強于對照組，但已有所減弱，與LPS相關程度亦在下降。一方面可能與NF-κB活化的反饋調節(jié)機制有關，另一方面亦可能與NF-κB不是唯一的基因調控機制有關，體現(xiàn)了SWD-ALI發(fā)病機制的復雜性。

NF-κB活化的調節(jié)途徑有正、負反饋兩個方向，其中TNF-α、IL-1β既是NF-κB活化的激動劑，又是受其調節(jié)的轉錄產(chǎn)物[9-11];而抗炎細胞因子IL-10等則有抑制 NF-κB 活化的功能[11-12]，NF-κB 狀態(tài)取決于占優(yōu)勢的調節(jié)方式。TNF-α、IL-1β是在全身及局部炎癥反應早期起重要作用的炎癥細胞因子，亦是構成炎性損傷級聯(lián)放大效應的重要組成部分。本實驗中，海水淹溺后早期伴隨 NF-κB轉錄活性的上升，肺組織中TNF-α、IL-1β濃度也在相應增加，并于6 h達峰值，雖然由于機體自我清除機制，隨著時間推移亦在自行下降[13]，但下降速度比較緩慢，24 h時仍維持在2倍于對照組的水平，與肺通透指數(shù)、肺損傷程度的動態(tài)演變密切相關，尤其IL-1β在監(jiān)測的24 h內始終與NF-κB活性保持相關性，該正反饋機制促使著炎癥反應的擴大和持續(xù)。轉錄因子和促炎癥細胞因子在不同層面協(xié)同參與了SWD-ALI的發(fā)病機制。IL-10表達量雖然亦明顯增高，但未能表現(xiàn)出抑制NF-κB轉錄活性的作用。提示海水淹溺激活急性炎癥反應的同時，亦激活了機體的抗炎反應，只是抗炎反應不足以對抗炎癥反應，正、負反饋調節(jié)的不協(xié)調性進一步導致大量促炎和抗炎介質的釋放及組織的損傷，機體穩(wěn)態(tài)破壞，形成了ALI。

文獻報道NF-κB是產(chǎn)生炎癥因子的總環(huán)節(jié)，因其在急性炎癥反應時的中心調控作用，被稱為極具潛力的新型抗炎靶點。在我們的SWD-ALI模型中，NF-κB活化持續(xù)存在，與早期炎癥因子的過度釋放密切相關。提示在SWD-ALI的炎癥反應放大環(huán)路中，NF-κB同樣起著重要作用，及時適量地抑制NF-κB活性或許可以成為SWD-ALI重要防治措施。

[1]Le Page C，Popescu O，Génin P，et al.Disruption of NF-kappa B signaling and chemokine gene activation by retroviral mediated expression of IKK gamma/NEMO mutants[J].Virology，2001，286(2):422-433.

[2]芮萌，段蘊鈾，張新紅，等.海水淹溺型急性肺損傷兔外周血中性粒細胞凋亡的動態(tài)變化[J].解放軍醫(yī)學雜志，2009，34(7):826-829.

[3]芮萌，段蘊鈾，張新紅，等.中性粒細胞活化在海水淹溺致肺損傷中的作用[J].中國急救醫(yī)學，2010，30(7):618-621，封 3.

[4]Orlowski JP，Szpilman D.Drowning，Rescue，resuscitation，and reanimation[J].Pediatr Clin North Am，2001，48(3):627-646.

[5]Matsuda N，Hattori Y.Systemic inflammatory response syndrome(SIRS):molecular pathophysiology and gene therapy[J].J Pharmacol Sci，2006，101(3):189-198.

[6]Vykhovanets EV，Shukla S，MacLennan GT，et al.IL-1 beta-induced post-transition effect of NF-kappa B provides time-dependent wave of signals for initial phase of intrapostatic inflammation[J].Prostate，2009，69(6):633-643.

[7]Zheng C，Yin Q，Wu H.Structural studies of NF-κB signaling[J].Cell Res，2011，21(1):183-195.

[8]Wang F，Xia ZF，Chen XL，et al.Angiotensin Ⅱ type-1 receptor antagonist attenuates LPS-induced acute lung injury[J].Cytokine，2009，48(3):246-253.

[9]Wu C，Wang P，Rao J，et al.Triptolide alleviates hepatic ischemia/reperfusion injury by attenuating oxidative stress and inhibiting NF-κB activity in mice[J].J Surg Res，2011，166(2):e205-e213.

[10]Song XQ，Lv LX，Li WQ，et al.The interaction of nuclear factor-kappa B and cytokines is associated with schizophrenia[J].Biol Psychiatry，2009，65(6):481-488.

[11]Punsawad C，Krudsood S，Maneerat Y，et al.Activation of nuclear factor kappa B in peripheral blood mononuclear cells from malaria patients[J].Malar J，2012，11:191.

[12]Asadullah K，Sterry W，Volk HD.Interleukin-10 therapy--review of a new approach[J].Pharmacol Rev，2003，55(2):241-269.

[13]Malleo G，Mazzon E，Siriwardena AK，et al.Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis:from biological basis to clinical evidence[J].Shock，2007，28(2):130-140.