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    海水淹溺型急性肺損傷早期肺組織核因子-κB及相關(guān)細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化

    2012-10-16 01:20:02寧浩勇張新紅王大鵬段蘊(yùn)鈾
    轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志 2012年2期

    芮 萌,王 津,寧浩勇,張新紅,王大鵬,段蘊(yùn)鈾

    海水淹溺型急性肺損傷(seawater drowninginduced acute lung injury,SWD-ALI)是 ALI的一個(gè)特殊類(lèi)型,由于海水高滲、偏堿等特性,使SWD-ALI具有病情重、變化快、救治難度大的特點(diǎn),并成為海水淹溺主要死亡原因。與其他直接損傷因素一樣,淹溺導(dǎo)致海水吸入不僅會(huì)直接損傷肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞,而且還會(huì)通過(guò)激活急性炎癥反應(yīng),引起肺局部甚至全身炎癥反應(yīng)綜合征,后者更是進(jìn)一步成為導(dǎo)致ALI多種病理過(guò)程的主要因素。已有資料顯示,炎癥反應(yīng)關(guān)鍵性控制點(diǎn)可能是位于胞漿中的核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB),其作用猶如核內(nèi)炎癥介質(zhì)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)開(kāi)關(guān)[1],調(diào)節(jié)多種參與炎癥免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、黏附分子及蛋白酶類(lèi)的基因轉(zhuǎn)錄,以控制它們的生物合成,但NF-κB活化在SWD-ALI發(fā)生、發(fā)展中的作用鮮見(jiàn)報(bào)道。為此,我們通過(guò)建立兔SWD-ALI模型,借助非放射性凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)等方法,觀察肺組織 NF-κB活性及相關(guān)細(xì)胞因子在SWD-ALI發(fā)病過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化,為SWD-ALI發(fā)病機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 選用健康新西蘭兔(購(gòu)自北京科宇動(dòng)物養(yǎng)殖中心,普通級(jí),合格證號(hào):SCXK2京2200220005),雌雄不拘,體質(zhì)量(2.20±0.25)kg。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(作為0 h基線值,即0h組)和海水灌注1 h(S1h)組、3 h(S3h)組、6 h(S6h)組、12 h(S12h)組、24 h(S24h)組(分別于海水灌注后 1、3、6、12、24 h 處死動(dòng)物,檢測(cè)相關(guān)指標(biāo))。

    1.2 動(dòng)物模型制備和處理 動(dòng)物模型制備參照文獻(xiàn)[2-3]。新西蘭兔經(jīng)速眠新和氯胺酮(1∶1)1 ml/kg肌內(nèi)注射麻醉(后續(xù)實(shí)驗(yàn)中按需給予1∶1速眠新和氯胺酮維持動(dòng)物麻醉狀態(tài)),仰臥固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)。頸總動(dòng)脈插管,連接三通,用于監(jiān)測(cè)血壓、心率、呼吸,給藥及獲得血標(biāo)本。氣管切開(kāi),插入“Y”型玻璃套管。海水灌注組通過(guò)“Y”型玻璃套管,注入2 ml/kg的配方海水[2],5 min內(nèi)灌完,呼吸空氣,于灌注后0.5 h開(kāi)始間斷檢測(cè)動(dòng)脈血?dú)?,根?jù)動(dòng)脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen,PaO2)和吸入氧濃度(forced inspiratory oxygen,F(xiàn)iO2)結(jié)果計(jì)算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)=PaO2/0.21,以200≤PaO2/FiO2≤300且持續(xù)1 h以上作為模型制備成功的標(biāo)準(zhǔn)。按照分組分別于灌注后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)抽血處死;對(duì)照組完成手術(shù)操作,不灌注液體,直接抽血處死。

    1.3 標(biāo)本采集 各組動(dòng)物處死前抽血查總蛋白(total protein,TP),隨后迅速開(kāi)胸、夾閉氣管取全肺。肺組織處理:①取右上、中肺稱濕重(wet weight,W),置于80℃烘箱內(nèi)干燥72 h至恒重,稱肺干重(dry weight,D),計(jì)算肺濕干重比值(W/D)。②取右下肺作肺泡灌洗,用10 ml生理鹽水分2次進(jìn)行灌洗,灌洗液回收量在80%以上,離心,上清液檢測(cè)TP。計(jì)算肺通透指數(shù)(lung permeability index,LPI)=灌洗液TP/血清TP。③在左下肺相應(yīng)部位分別取2份肺組織;1份用4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片,蘇木素和伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色,另外1份-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 細(xì)胞因子濃度測(cè)定 取凍存肺組織200 mg左右,在體積總量為組織重量9倍的預(yù)冷生理鹽水中,研磨制備組織均漿。采用雙抗夾心ELISA法測(cè)定肺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-10等細(xì)胞因子濃度。操作按試劑盒(Rapidbio公司,美國(guó))說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

    1.5 肺組織核蛋白提取和NF-κB活性測(cè)定 采用非放射性EMSA。取凍存肺組織300 mg左右,按說(shuō)明書(shū)步驟抽提核蛋白(Viagene公司,美國(guó)),測(cè)定核蛋白濃度(碧云天生物公司)。取5 μg核蛋白與400 fmol(1 fmol=10-15mol=10-3pmol)生物素雙標(biāo)NF-κB探針室溫孵育20 min,6.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,通過(guò)電轉(zhuǎn)移法將DNA-蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)移到結(jié)合膜上,紫外燈下交聯(lián)固定10 min,室溫封閉30 min,與新配制的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(Streptavidin-HRP)反應(yīng)液室溫孵育20 min,洗滌平衡后,將化學(xué)發(fā)光試劑加于結(jié)合膜表面,立即以Cool Imager(Viagene公司,美國(guó))進(jìn)行化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像。以積分灰度值表示NF-κB活性。Bio-NF-κB探針序列為5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'。Cold-NF-κB探針序列同前。陽(yáng)性對(duì)照為T(mén)HP-1細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α刺激后得到的NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)陽(yáng)性物質(zhì)。

    1.6 肺組織病理觀察 肺損傷病理評(píng)分(lung pathologic score,LPS)參照有關(guān)資料[3]進(jìn)行,每組取6張切片,每張切片取5個(gè)視野,根據(jù)毛細(xì)血管淤血、肺泡腔纖維蛋白滲出、中性粒細(xì)胞滲出、肺泡間隔增寬等項(xiàng)目的得分,將每個(gè)視野各項(xiàng)積分相加,將等級(jí)資料轉(zhuǎn)換為計(jì)量資料,分析判斷肺損傷程度。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)數(shù)據(jù)的比較均采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,若有差異,則采用SNK-q法進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較;對(duì)同一組處理后各時(shí)間點(diǎn)與處理前的比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。NF-κB與各指標(biāo)相關(guān)性分析采用直線相關(guān)完成。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PaO2/FiO2的變化 海水灌注后 0.5、1、2、3、6 h PaO2/FiO2依次為(203.8±37.8)、(248.7±67.0)、(253.2 ±73.6)、(287.8 ±14.0)、(308.2 ±61.0)mmHg,與對(duì)照組(422.8±42.6)mmHg比差異顯著(P <0.01)。0.5、1、2、3 h 的 PaO2/FiO2均>200 mmHg且 <300 mmHg,表明 SWD-ALI模型制備成功。

    2.2 肺組織病理改變 肺大體標(biāo)本以S3h組淤血水腫最嚴(yán)重,呈暗紅色,體積最大,與肺損傷指標(biāo)的變化大體一致。HE染色顯示對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)清晰、擴(kuò)張均勻,肺泡壁薄,肺間質(zhì)未見(jiàn)明顯水腫、出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。S1h組以肺間質(zhì)淤血最明顯,S3h組肺間質(zhì)淤血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均較顯著,S6h、S12h組以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最突出;肺泡間隔寬度、肺泡腔塌陷或擴(kuò)張范圍和程度,隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重,S12h組肺泡隔明顯增寬(不均勻),S24h組大部分區(qū)域已失去正常肺泡結(jié)構(gòu)(圖1)。各海水灌注組LPS與對(duì)照組比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),以S6h組LPS最高,6 h后各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

    圖1 海水灌注后各時(shí)間點(diǎn)肺組織HE染色(×100)

    表1 各組肺病理評(píng)分、W/D和肺通透指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

    2.3 肺損傷指標(biāo)的變化 由表1可見(jiàn),與對(duì)照組相比,各海水灌注組肺通透指數(shù)顯著增高(P<0.05),并以S6h組數(shù)值最高,但與S12h組、S24h組比較無(wú)差異。W/D于3 h達(dá)高峰,6 h有所下降,但仍明顯高于對(duì)照組(P<0.01),S12h組、S24h組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2.4 肺組織 TNF-α、IL-1β、IL-10變化 與對(duì)照組相比,海水組各時(shí)間點(diǎn)肺組織 TNF-α、IL-1β、IL-10均顯著增高(P<0.05),并以S6h組數(shù)值最高(圖2)。

    圖2 兔SWD-ALI時(shí)肺組織細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化

    2.5 肺組織NF-κB DNA結(jié)合活性的變化 海水灌注后1 h肺組織核提取物NF-κB DNA復(fù)合物電泳圖與對(duì)照組相比有所增強(qiáng),3~6 h達(dá)高峰;12~24 h有所減弱,但仍明顯強(qiáng)于對(duì)照組;同一時(shí)間點(diǎn)積分灰度值亦相應(yīng)地高于對(duì)照組(P<0.05,圖3)。

    圖3 各組NF-κB DNA復(fù)合物EMSA電泳條帶及積分灰度值

    2.6 相關(guān)性分析 0~6 h時(shí)間段內(nèi),NF-κB活性與TNF-α、IL-1β、IL-10 及 LPS 正相關(guān),相關(guān)系數(shù) r分別為0.971、0.981、0.987、0.967(P < 0.05)。0 ~24 h時(shí)間段內(nèi),NF-κB活性僅與肺組織IL-1β、IL-10保持相關(guān)性,r分別為0.827、0.816(P < 0.05)。TNF-α、IL-1β、IL-10 與 LPS 正相關(guān),r分別為0.900、0.847、0.904(P <0.05)。TNF-α、IL-1β、IL-10 與 LPI的相關(guān)系數(shù)分別為0.833、0.828、0.851(P <0.05)。

    3 討論

    肺是淹溺后受損的主要器官。已有學(xué)者報(bào)道吸入1~3 ml/kg的液體就足以使人肺氣體交換功能產(chǎn)生顯著障礙,肺順應(yīng)性降低10%~40%[4]。為此本實(shí)驗(yàn)選用2 ml/kg體質(zhì)量的液體量制備兔SWDALI模型。灌入海水后,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氧合指數(shù)0.5~3 h均在200~300 mmHg之間,直至6 h才超過(guò)300 mmHg;肺濕干重比值明顯高于對(duì)照組;肺通透指數(shù)1 h時(shí)已顯著增高,6 h后基本維持在高峰水平,提示肺泡毛細(xì)血管通透性的增加持續(xù)存在。病理學(xué)檢查可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡水腫、肺間質(zhì)淤血增寬等ALI征象,均提示SWD-ALI模型制備成功。

    肺內(nèi)過(guò)度性、失控性炎癥反應(yīng)是各種致病因素導(dǎo)致ALI的根本原因,基因調(diào)控在炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展中的地位日益受到重視,其中NF-κB被證實(shí)具有關(guān)鍵作用。NF-κB屬于Rel家族,幾乎存在于所有真核細(xì)胞,典型組成為p50/p65異源二聚體,通常與其特定抑制蛋白IκB耦聯(lián),以無(wú)活性形式存在于胞漿內(nèi)。經(jīng)典的 NF-κB活化途徑聚焦于 IκB激酶(IκB kinase,IKK)復(fù)合體,各種刺激信號(hào)借助受體將信號(hào)傳遞至胞漿,通過(guò)激活I(lǐng)KK,磷酸化IκB,解離 NF-κB,并迅速觸發(fā)泛素-蛋白酶體系降解 IκB。游離的NF-κB二聚體因暴露核定向信號(hào)而活化,移入核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合,并促使基因轉(zhuǎn)錄[5-8]。本實(shí)驗(yàn)中,海水灌注后1 h NF-κB含量和活性已顯著增高,3 h活化的NF-κB就已增加了2.5倍(107.82/42.65);當(dāng)肺泡毛細(xì)血管通透性進(jìn)行性增加,肺損傷進(jìn)一步加重時(shí),NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增加的倍數(shù)也上升到2.9(6 h,125.34/42.65),在肺損傷進(jìn)行性加重至高峰過(guò)程中,NF-κB活性亦進(jìn)行性升高,兩者之間顯著相關(guān)。提示SWD-ALI早期NF-κB激活參與了肺損傷發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程。12~24 h NF-κB活性仍明顯強(qiáng)于對(duì)照組,但已有所減弱,與LPS相關(guān)程度亦在下降。一方面可能與NF-κB活化的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān),另一方面亦可能與NF-κB不是唯一的基因調(diào)控機(jī)制有關(guān),體現(xiàn)了SWD-ALI發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。

    NF-κB活化的調(diào)節(jié)途徑有正、負(fù)反饋兩個(gè)方向,其中TNF-α、IL-1β既是NF-κB活化的激動(dòng)劑,又是受其調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[9-11];而抗炎細(xì)胞因子IL-10等則有抑制 NF-κB 活化的功能[11-12],NF-κB 狀態(tài)取決于占優(yōu)勢(shì)的調(diào)節(jié)方式。TNF-α、IL-1β是在全身及局部炎癥反應(yīng)早期起重要作用的炎癥細(xì)胞因子,亦是構(gòu)成炎性損傷級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)的重要組成部分。本實(shí)驗(yàn)中,海水淹溺后早期伴隨 NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的上升,肺組織中TNF-α、IL-1β濃度也在相應(yīng)增加,并于6 h達(dá)峰值,雖然由于機(jī)體自我清除機(jī)制,隨著時(shí)間推移亦在自行下降[13],但下降速度比較緩慢,24 h時(shí)仍維持在2倍于對(duì)照組的水平,與肺通透指數(shù)、肺損傷程度的動(dòng)態(tài)演變密切相關(guān),尤其IL-1β在監(jiān)測(cè)的24 h內(nèi)始終與NF-κB活性保持相關(guān)性,該正反饋機(jī)制促使著炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大和持續(xù)。轉(zhuǎn)錄因子和促炎癥細(xì)胞因子在不同層面協(xié)同參與了SWD-ALI的發(fā)病機(jī)制。IL-10表達(dá)量雖然亦明顯增高,但未能表現(xiàn)出抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的作用。提示海水淹溺激活急性炎癥反應(yīng)的同時(shí),亦激活了機(jī)體的抗炎反應(yīng),只是抗炎反應(yīng)不足以對(duì)抗炎癥反應(yīng),正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)的不協(xié)調(diào)性進(jìn)一步導(dǎo)致大量促炎和抗炎介質(zhì)的釋放及組織的損傷,機(jī)體穩(wěn)態(tài)破壞,形成了ALI。

    文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB是產(chǎn)生炎癥因子的總環(huán)節(jié),因其在急性炎癥反應(yīng)時(shí)的中心調(diào)控作用,被稱為極具潛力的新型抗炎靶點(diǎn)。在我們的SWD-ALI模型中,NF-κB活化持續(xù)存在,與早期炎癥因子的過(guò)度釋放密切相關(guān)。提示在SWD-ALI的炎癥反應(yīng)放大環(huán)路中,NF-κB同樣起著重要作用,及時(shí)適量地抑制NF-κB活性或許可以成為SWD-ALI重要防治措施。

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