張金山 趙潔 李臻等
[摘要] 目的 觀察模擬失重狀態(tài)下大鼠血清和下頜下腺內(nèi)Ghrelin表達(dá)的變化,為探討航天失重環(huán)境下消化系統(tǒng)功能紊亂的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 采用尾懸吊模擬失重模型,30只Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為4周懸吊組(n=15)和正常對(duì)照組(n = 15),用酶免疫分析(EIA)法測(cè)定動(dòng)物血清和下頜下腺組織中Ghrelin的濃度。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較,模擬失重組大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平均顯著降低[(7.14±1.65)μg/L vs (5.72±1.42)μg/L,P < 0.05;(8.36±1.87)μg/gvs (6.45±2.06)μg/g,P<0.01)]。 結(jié)論 模擬失重環(huán)境可致大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平下降,Ghrelin可能參與模擬失重環(huán)境下消化系統(tǒng)功能紊亂的調(diào)節(jié)。
[關(guān)鍵詞] 模擬失重;Ghrelin;血清;下頜下腺;大鼠
[中圖分類號(hào)] R576.06[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-7210(2012)05(c)-0029-03
失重導(dǎo)致的宇航員厭食和體重下降是當(dāng)前航天醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一。航天性厭食癥表現(xiàn)為航天飛行過(guò)程中出現(xiàn)熱量攝入減少和體重下降,嚴(yán)重影響航天員的耐力和執(zhí)行力[1]。失重導(dǎo)致航天員消化道功能紊亂(如厭食癥和體重下降)的機(jī)制仍不完全清楚。攝食相關(guān)激素與食欲和維持機(jī)體的能量穩(wěn)態(tài)密切相關(guān),目前已知與航天性厭食和體重下降有關(guān)的攝食相關(guān)激素包括神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、5-羥色胺(serotonin,5-HT)、促皮質(zhì)激素釋放素(corticotropin-releasing factor,CRF)和瘦素等[2-4]。Ghrelin是生長(zhǎng)激素促分泌劑受體(GHS-R)的內(nèi)源性配體,可刺激食欲及攝食,調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡,促進(jìn)胃動(dòng)力和胃酸分泌,促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放、抗炎癥及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功能[5-6]。最近的研究表明,人和哺乳類動(dòng)物唾液腺可合成和分泌Ghrelin,唾液中亦檢出Ghrelin蛋白[7-9]。志愿者頭低位傾斜臥床模擬失重模型中,唾液中應(yīng)激因子(α-淀粉酶、皮質(zhì)酮、CgA和β-內(nèi)啡肽)水平明顯升高,提示模擬失重可導(dǎo)致唾液腺分泌功能的變化[10]。為探討Ghrelin在航天所致消化系統(tǒng)功能紊亂中的作用及其機(jī)制,本研究采用尾懸吊大鼠模型,觀察模擬失重大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平的變化,為深入研究航天失重所致消化功能紊亂的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只(第四軍醫(yī)大學(xué)訓(xùn)練部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體質(zhì)量180~200 g,動(dòng)物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵守本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與使用的規(guī)定。
大鼠血清Ghrelin檢測(cè)EIA試劑盒購(gòu)自ADL(Adlitteram Diagnostic Laboratories)公司。
1.2 方法
1.2.1 模擬失重大鼠模型按隨機(jī)原則將大鼠分為模擬失重組(n=15)和正常對(duì)照組(n=15)。采用-30°尾懸吊模擬失重動(dòng)物模型,每只籠內(nèi)懸吊一只大鼠,尾部懸于籠頂,使鼠前肢踏于籠底的塑料棒上,后肢懸空,身體縱軸與水平面成30°;正常對(duì)照組除不懸吊外,其他條件與模擬失重組相同,實(shí)驗(yàn)期間兩組大鼠均可自由攝食和飲水。
1.2.2 大鼠血清和下頜下腺組織制備尾懸吊模擬失重4周結(jié)束后,將兩組大鼠在烏拉坦(1.2 g/kg體重)腹腔注射麻醉下,剖開(kāi)胸腔,暴露心臟,用一次性注射器左心室內(nèi)取血3 mL于4℃靜置2 h,4 000 r/min離心15 min取上清液,置-70℃保存?zhèn)溆?。然后做頸部切口,分離下頜下腺組織,稱重,用2 mL勻漿器勻漿(加1 mL PBS),組織勻漿液用樣品稀釋液稀釋5倍。-70℃保存,留待EIA檢測(cè)。
1.2.3 大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平檢測(cè)應(yīng)用酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)方法檢測(cè)懸吊和正常對(duì)照大鼠血清中和下頜下腺組織中Ghrelin水平。EIA檢測(cè)的具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,主要程序如下:①于空白微孔內(nèi)依次滴加標(biāo)準(zhǔn)品、血清或組織勻漿樣品100 μL;②于標(biāo)準(zhǔn)品或樣品孔中加入酶標(biāo)記液50 μL;③37℃孵育反應(yīng)60 min;④洗板機(jī)清洗5次,每次靜置20 s;⑤在標(biāo)準(zhǔn)品或樣品孔中加入底物A、B液各50 μL;⑥37℃下避光孵育反應(yīng)15 min;⑦每孔內(nèi)加入終止液50 μL,終止反應(yīng);⑧輕輕混勻,30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的A值(450 nm濾色片)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
尾懸吊模擬失重組與正常對(duì)照組大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平的EIA檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組比較,模擬失重大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。
3 討論
失重是航天過(guò)程中重要的環(huán)境因子,可引起機(jī)體多種器官系統(tǒng)的生理功能改變,因而對(duì)失重狀態(tài)下宇航員身體各器官系統(tǒng)變化的研究日益受到重視。長(zhǎng)期處于失重環(huán)境中,航天人員易出現(xiàn)食欲下降、腹脹和消化不良等胃腸功能紊亂癥狀,并導(dǎo)致攝食減少和體重下降。目前已有一些針對(duì)失重狀態(tài)下胃腸功能變化的研究,如模擬失重狀態(tài)可造成腸道菌群失調(diào);血循環(huán)和胃腸黏膜中神經(jīng)肽和胃腸激素(生長(zhǎng)抑素、胃動(dòng)素、5-HT、CRF、NPY/AgRP和瘦素等)水平改變;小腸黏膜微絨毛和絨毛表面積減少且排列紊亂;腸系膜動(dòng)脈血管收縮,導(dǎo)致小腸血供減少等。Ghrelin是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一種GHS-R內(nèi)源性配體,循環(huán)中的Ghrelin主要由胃X/A樣細(xì)胞產(chǎn)生,有?;腿ヵ;瘍煞N存在形式。血循環(huán)中?;腉hrelin只占很少的一部分,其?;^(guò)程由Ghrelin?;D(zhuǎn)移酶(Ghrelin O-Acyltransferase,GOAT)完成。?;疓hrelin通過(guò)GHS-R1a型受體發(fā)揮作用,GHS-R1a廣泛分布于人體多種組織,如下丘腦、垂體、海馬、大腦皮質(zhì)、胃腸胰系統(tǒng)、腎、心肌、腎上腺、肺、卵巢和肌肉等。由此可見(jiàn),Ghrelin在消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管、生殖及免疫系統(tǒng)均可能發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。
本研究結(jié)果表明,4周尾懸吊模擬失重大鼠血清和下頜下腺組織中Ghrelin水平均顯著下降,說(shuō)明模擬失重可引起體內(nèi)Ghrelin生成和分泌活動(dòng)減弱,由于Ghrelin可刺激食欲和促進(jìn)攝食行為,這一研究結(jié)果可部分解釋航天失重時(shí)出現(xiàn)的食欲下降和厭食。下頜下腺可合成和分泌多種生物活性物質(zhì),參與機(jī)體的多種生理反應(yīng)。Rai等[10]對(duì)12例男性志愿者所作的-6°頭低位臥床21 d模擬失重模型的研究發(fā)現(xiàn),臥床1周后受試者出現(xiàn)心理應(yīng)激反應(yīng),唾液中應(yīng)激性激素CgA、皮質(zhì)醇、α-淀粉酶和β-內(nèi)啡肽水平較臥床前顯著升高,并在隨后的2周臥床期間繼續(xù)緩慢升高。唾液腺組織中Ghrelin的定位研究多來(lái)自人的材料,Aydin等[8]首先比較了青年健康人群血漿和唾液中Ghrelin水平,發(fā)現(xiàn)唾液中Ghrelin水平顯著高于血漿,免疫組化染色顯示唾液腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞呈Ghrelin免疫反應(yīng)陽(yáng)性。隨后的研究表明[7,9],唾液腺可合成與分泌Ghrelin,Ghrelin-mRNA表達(dá)于人腮腺和下頜下腺、而舌下腺內(nèi)未檢出Ghrelin-mRNA;Ghrelin蛋白廣泛表達(dá)于腮腺和下頜下腺紋狀管、閏管、分泌管和漿液性腺泡細(xì)胞的胞漿,但舌下腺的黏液性腺泡細(xì)胞無(wú)Ghrelin蛋白表達(dá)。腮腺和下頜下腺的合成與釋放是唾液中Ghrelin的主要來(lái)源。
多種疾病時(shí)可出現(xiàn)唾液和血漿Ghrelin的波動(dòng)。肥胖型2型糖尿病患者唾液中Ghrelin水平顯著下降;胃癌和唾液腺黏液表皮癌組織中Ghrelin表達(dá)亦明顯降低;癲癇患者治療前血清和唾液腺Ghrelin水平顯著低于正常對(duì)照;病理性肥胖和正常人群空腹唾液Ghrelin水平顯著高于血清,病理性肥胖人群標(biāo)準(zhǔn)餐后血清Ghrelin水平無(wú)明顯受抑制,而唾液中Ghrelin水平卻顯著下降[11-14]。
有關(guān)Ghrelin在唾液腺表達(dá)的功能研究證明,Ghrelin可促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖,并且這種作用可被Ghrelin特異性抑制劑NOX-B11阻斷[9]。Ohta等[15]觀察Ghrelin對(duì)TNF-α或LPS刺激下口腔上皮細(xì)胞IL-8分泌的影響。發(fā)現(xiàn)Ghrelin可增加口腔上皮細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員和cAMP水平;合成的Ghrelin抑制TNF-α或LPS刺激下口腔上皮細(xì)胞IL-8的合成與分泌,提示Ghrelin可對(duì)炎性感染的固有免疫反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。Ghrelin抗LPS-誘導(dǎo)的腺泡細(xì)胞凋亡活動(dòng)與cNOS活性增強(qiáng)、iNOS和Caspase-3表達(dá)下降有關(guān),Ghrelin參與SrC/Akt-介導(dǎo)的cNOS活化和NO-誘導(dǎo)的Caspase-3 S-亞硝基化凋亡信號(hào)途徑[16]。
本研究通過(guò)對(duì)模擬失重狀態(tài)下大鼠血清和下頜下腺Ghrelin表達(dá)的檢測(cè),證明了Ghrelin可能在航天失重環(huán)境下機(jī)體內(nèi)分泌和代謝紊亂中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步探討失重條件下Ghrelin與其他攝食相關(guān)激素之間的相互作用,將有助于闡明失重引起胃腸功能紊亂的機(jī)制,為完善載人航天醫(yī)務(wù)保障提供理論支持。
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(收稿日期:2012-03-19本文編輯:衛(wèi) 軻)