海洋鏈霉菌M506的鑒定及代謝產(chǎn)物抑菌活性初步研究

朱本偉 , 李富超 秦 松

(1. 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東 煙臺(tái) 264003; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071; 3. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京 100049)

半個(gè)世紀(jì)以來(lái), 陸生微生物成為抗生素等各種生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源, 但由于資源匱乏、研究方法滯后及篩選模型的陳舊, 近年來(lái)尋找到具有全新結(jié)構(gòu)或特殊活性化合物的幾率大幅度下降。海洋中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源, 海洋微生物可能具有陸生微生物所不具有的化合物結(jié)構(gòu)及生物活性, 海洋微生物尤其是海洋放線菌成為新結(jié)構(gòu)活性化合物的重要來(lái)源[1]。近年來(lái), 每年發(fā)現(xiàn)的新穎海洋新天然產(chǎn)物化合物分子超過(guò)1 000個(gè), 而其中海洋微生物來(lái)源的新化合物也呈逐年遞增的趨勢(shì)[2-4]。

青島膠州灣是典型的半封閉型淺水海灣, 水產(chǎn)養(yǎng)殖、港口設(shè)施等人類(lèi)活動(dòng)影響明顯, 陸源物質(zhì)輸入豐富, 微生物種類(lèi)繁多, 尤其是海洋放線菌多樣性豐富。本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了多年的膠州灣沉積物海洋放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究, 發(fā)現(xiàn)了一批具有抗菌、抗腫瘤等顯著生物活性的新結(jié)構(gòu)化合物[5-9], 并且建立了培養(yǎng)條件的優(yōu)化技術(shù), 通過(guò)海洋鏈霉菌培養(yǎng)條件的改變, 誘導(dǎo)其產(chǎn)生了一系列新結(jié)構(gòu)化合物[5-6]。因此本研究對(duì)分離自膠州灣沉積物中的一株海洋鏈霉菌M506, 進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化特征實(shí)驗(yàn)及分子鑒定, 并通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化, 研究其次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)受試細(xì)菌的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株M506分離自青島膠州灣沉積物, 保存于高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基中。選擇 6種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化: 高氏一號(hào)培養(yǎng)基(GI)、Zobell海洋細(xì)菌培養(yǎng)基(ZB)、蛋白胨-酵母粉培養(yǎng)基(LB), 以及豆粉-甘露醇培養(yǎng)基(SM)、麥芽浸粉培養(yǎng)基(M2+)和牛肉浸膏培養(yǎng)基(ME)[6]。

受試菌株: 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus), 大腸桿菌(Escherichia coli), 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis), 蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis), 受試菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)特征

菌株M506劃線接種于M2+固體培養(yǎng)基中, 將滅菌后的蓋玻片斜插到培養(yǎng)基中, 28℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,使菌絲體和孢子能附著生長(zhǎng)在蓋玻片上, 取出蓋玻片分別置于光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察菌絲體形態(tài)和孢子特征。

1.3 生理生化特征

參照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》及國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃(ISP),并補(bǔ)充使用杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)的非發(fā)酵細(xì)菌生化編碼鑒定管, 對(duì)菌株M506進(jìn)行生理生化特征實(shí)驗(yàn)。

1.4 16S rDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株 M506基因組總 DNA提取: 參照文獻(xiàn)[10]的酚/氯仿抽提方法。

16S rDNA的PCR擴(kuò)增和測(cè)序: 以菌株M506基因組DNA為模板, 利用引物P1 (27F): 5'-AGAGTTT GATCATGGCTCAG-3'和P2 (1390R): 5'-ACGGGC GGTGTCTACAA-3'進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR總體系為20 μL: 超純水 14.4 μL, 10×PCR Buffer 2 μL, 引物P1 和 P2 各 1 μL, 10 mmol/L dNTP 0.4 μL, Taq 酶 0.2 μL, 基因組DNA1μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5 min; (94℃變性50 s, 56℃退火50 s, 72℃延伸1.5 min)×30個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。把PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 然后利用 TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技有限公司)進(jìn)行 DNA 回收,回收產(chǎn)物連接到 pMD18-T(TakaRa公司)載體, 并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中, 挑取陽(yáng)性克隆, 送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析: 通過(guò)BLAST軟件從GenBank獲得與菌株 M506親緣關(guān)系最近的典型鏈霉菌菌株的16S rDNA序列, 用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì),利用MEGA 4.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及聚類(lèi)分析, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 通過(guò)自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè), 自舉數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.5 不同培養(yǎng)基對(duì)抑菌活性的影響

從菌株M506固體培養(yǎng)基上, 切取長(zhǎng)有豐富菌落的1 cm2大小的瓊脂塊, 接種到250 mL的GI、ZB、 L B、SM、M2+和ME六種液體培養(yǎng)基中, 28℃振蕩培養(yǎng)4～5 d。發(fā)酵液冷凍干燥后, 用乙酸乙酯浸提5～6次, 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后獲得粗提物, 溶于 1 mL甲醇/氯仿(1:1)混合溶劑中備用。

抑菌試驗(yàn)采用抑菌紙片法: 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的受試菌株培養(yǎng)液和熔化的LB固體培養(yǎng)基混合, 倒入已鋪有一層LB固體培養(yǎng)基的平皿中, 待培養(yǎng)基充分凝固。用已消毒過(guò)的直徑6 mm的濾紙片吸取30 μL粗提物溶液, 充分揮干溶劑后, 將紙片貼于培養(yǎng)基表面, 于 37℃培養(yǎng) 24 h后, 測(cè)量透明圈直徑, 每株受試菌做三組平行實(shí)驗(yàn), 抑菌圈直徑取平均值。

2 結(jié)果

2.1 菌株的培養(yǎng)特征

鏈霉菌 M506在 M2+固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好, 產(chǎn)生灰色孢子, 基內(nèi)菌絲體無(wú)可溶性色素, 菌絲體短而彎曲, 分支少, 無(wú)橫隔, 頂端斷裂成孢子, 孢子呈橢球狀, 表面有突起(圖 1-a), 孢子鏈呈螺旋狀(圖 1-b), 孢子斷裂方式可能為孢子兩端向中心收縮。

圖1 菌株M506孢子鏈的顯微照片F(xiàn)ig. 1 Spore micrograph of marine strain M506

2.2 菌株的生理生化特征

如表1所示, 菌株M506可以利用葡萄糖、果糖、木糖及阿拉伯糖, 具有明膠液化、牛奶凝固、牛奶胨化等產(chǎn)酶活性。

表1 菌株M506與灰略紅鏈霉菌的生理生化特征比較Tab. 1 Comparison of physiological and biochemical characteristics between strain M506 and Streptomyces griseorubens

2.3 菌株M506的16S rDNA序列分析

圖2 菌株M506及相關(guān)菌株的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence showing the positions of strain M506 and related taxa.

菌株M506的16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果共1381bp,GenBank登錄號(hào)為 JQ327839。序列經(jīng)過(guò)校對(duì)后, 與GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行比較, 根據(jù)序列同源性從高到低的次序選取典型菌株的序列用于序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 如圖 2所示, 菌株M506與灰略紅鏈霉菌Streptomyces griseorubensNBRC 12780親緣關(guān)系最近, 相似性為99%, 結(jié)合生理生化特征, 可以利用葡萄糖, 不能利用蔗糖, 不產(chǎn)硫化氫, 氧化酶水解陽(yáng)性, 硝酸鹽還原酶陰性等, 大部分特征一致[11-12], 因此將菌株M506可以鑒定為灰略紅鏈霉菌。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株代謝產(chǎn)物組成及抑菌活性影響

通過(guò)抑菌紙片法活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 菌株 M506在M2+培養(yǎng)基和 SM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的粗提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌均具有較強(qiáng)的抑制活性(抑菌圈直徑大于16 mm), 如表2所示。而在其他四種培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得到的粗提物只對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑制活性, 因此, 海洋鏈霉菌M506在不同的培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物組分和活性均有顯著差異, 可以指導(dǎo)我們選擇合適的培養(yǎng)條件有目的分離純化有活性的化合物。

表2 菌株M506在不同培養(yǎng)條件下的粗提物抑菌活性Tab. 2 Antimicrobial activities of strain M506 crude extracts from different culture conditions

3 討論

近年來(lái), 陸地放線菌產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)化合物的概率在下降, 而新的疾病和病原微生物耐藥性的增加,使尋找新型活性先導(dǎo)化合物顯得極為迫切, 而海洋放線菌尤其是海洋鏈霉菌由于其生存環(huán)境的特殊性與多樣性, 使其具有特殊次級(jí)代謝途徑的潛力, 成為新穎活性物質(zhì)的重要來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)膠州灣海洋鏈霉菌的分離和篩選, 建立了包括培養(yǎng)條件優(yōu)化、活性篩選以及化學(xué)去重復(fù)等一系列有效的天然產(chǎn)物研究方法, 鑒定出了一批具有良好生物活性的新結(jié)構(gòu)化合物[5-9]。其中采用 6種不同培養(yǎng)基, 24種培養(yǎng)條件對(duì)海洋鏈霉菌M045的代謝產(chǎn)物分析, 獲得了具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的新結(jié)構(gòu)化合物chinikomycin A和chinikomycin B[6]。對(duì)海洋鏈霉菌M518培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化, 獲得了抗腫瘤活性極強(qiáng)的新結(jié)構(gòu)星形孢菌素等化合物[7]。因此本論文針對(duì)海洋鏈霉菌 M506, 通過(guò)不同培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng), 研究了其代謝產(chǎn)物的組分和活性差異, 發(fā)現(xiàn)在M2+和SM培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物對(duì)于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌均具有較強(qiáng)的抑制活性, 抑菌圈直徑大于 16 mm, 代謝產(chǎn)物的薄層層析分析(結(jié)果未顯示), 直觀地反映出其代謝產(chǎn)物組成上的差別, 可以有效指導(dǎo)我們下一步活性化合物的分離。因此, 在海洋鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物分離中,培養(yǎng)條件優(yōu)化是提高新結(jié)構(gòu)活性化合物發(fā)現(xiàn)幾率的很好的策略。

本研究同時(shí)對(duì)菌株M506進(jìn)行了鑒定, 通過(guò)形態(tài)觀察具有典型的鏈霉菌特征, 16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)其與灰略紅鏈霉菌Streptomyces griseorubensNBRC 12780親緣關(guān)系最近, 相似性高達(dá)99%, 結(jié)合生理生化特征實(shí)驗(yàn), 與灰略紅鏈霉菌的典型菌株特征基本相同, 所以我們把菌株M506鑒定為灰略紅鏈霉菌的一個(gè)菌株。而葉亮[11]、楊文鴿[12]以及肖靜[13]等也分別報(bào)道了從海洋沉積物中分離得到了與灰略紅鏈霉菌相似的鏈霉菌, 并且發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物具有抗菌和抗腫瘤等活性[14]。與陸生鏈霉菌-灰略紅鏈霉菌相比較, 該菌株在形態(tài)特征方面基本上無(wú)明顯差異,但在碳源利用等生理生化特性方面較有不同, 由于該菌株采自海底沉積物, 由于生境的不同, 會(huì)造成兩者在代謝途徑、遺傳及生態(tài)功能方面存在差異。本研究通過(guò)培養(yǎng)條件優(yōu)化, 獲得了海洋鏈霉菌M506產(chǎn)抑菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)條件, 而海洋灰略紅鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化鮮有報(bào)道, 因此該研究下一步工作將對(duì)鏈霉菌 M506進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng), 從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到具有活性的化合物分子。

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