大黃魚選育群體與普通養(yǎng)殖群體部分免疫指標(biāo)的比較

楊啟蓮, 姚翠鸞, 王志勇

(集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 廈門 361021)

大黃魚(Larimichthys crocea)在分類上屬鱸形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Larimichthys), 為暖水性近距離洄游魚類, 是中國(guó)特有的海水養(yǎng)殖魚類之一。20世紀(jì)80年代中期, 大黃魚人工繁殖在福建省首獲成功, 90年代初開始進(jìn)行全人工養(yǎng)殖, 從90年代中期開始迅速發(fā)展成為中國(guó)養(yǎng)殖量最大的海水魚和最具優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一。但是經(jīng)過多代的人工養(yǎng)殖, 由于近親繁殖、種質(zhì)退化, 人工繁殖和育苗過程中不科學(xué)的操作等原因, 導(dǎo)致了苗種質(zhì)量下降, 大黃魚養(yǎng)殖群體普遍出現(xiàn)了生物學(xué)性狀退化現(xiàn)象, 表現(xiàn)在抗病力/抗逆性下降、生長(zhǎng)速度變慢等方面[1-2]。另外, 由于養(yǎng)殖密度過高、養(yǎng)殖環(huán)境惡化, 導(dǎo)致近年來頻發(fā)養(yǎng)殖大黃魚大規(guī)模病害, 且其程度呈逐年加重趨勢(shì), 嚴(yán)重制約著大黃魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。

培育高產(chǎn)、抗病優(yōu)良品種在海水經(jīng)濟(jì)魚類養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中具有重要意義, 也得到了科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注。陳松林等[5-6]采用人工感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的策略結(jié)合家系選育, 篩選出牙鲆(Paralichthys olivaceus)和半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)的抗病家系, 在鰻弧菌感染后的成活率均大幅度提高, 為后續(xù)優(yōu)良品種的選育奠定了良好的基礎(chǔ)。針對(duì)大黃魚養(yǎng)殖中出現(xiàn)的種質(zhì)退化問題, 本課題組從2001年開始進(jìn)行大黃魚品種選育研究, 以從福建省寧德市官井洋海區(qū)采捕馴養(yǎng)的閩粵東族大黃魚原種為親本, 采用群體選擇的方法、結(jié)合人工雌核發(fā)育促進(jìn)基因純合技術(shù)進(jìn)行大黃魚遺傳改良, 經(jīng)連續(xù)5代選育, 培育出“閩優(yōu)1號(hào)”大黃魚新品種, 具有生長(zhǎng)快、抗逆性較強(qiáng)、養(yǎng)殖成活率高的優(yōu)良特點(diǎn)。但是, 對(duì)于培育的大黃魚抗病免疫的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚。

因此, 本研究選取白細(xì)胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、血清殺菌活力、血清和血細(xì)胞SOD活力及白蛋白等魚類的重要免疫指標(biāo), 對(duì)“閩優(yōu)1號(hào)”和普通養(yǎng)殖大黃魚群體進(jìn)行比較分析, 以期了解大黃魚的抗病免疫特性, 為大黃魚優(yōu)良品種的進(jìn)一步選育提供參考資料和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 非特異性免疫指標(biāo)檢測(cè)分析

1.1.1 試驗(yàn)用魚

試驗(yàn)于2010年夏季在福建省寧德市橫嶼島水產(chǎn)有限公司育苗場(chǎng)進(jìn)行?！伴}優(yōu)1號(hào)”大黃魚取自該公司漁排, 系本研究團(tuán)隊(duì)2010年春季繁育的F5, 在海區(qū)養(yǎng)殖4個(gè)月, 平均體質(zhì)量為7.53 g±1.67 g, 體長(zhǎng)為7.15 cm±0.66 cm。對(duì)照組為在同樣日齡和同樣環(huán)境下養(yǎng)殖而成的未經(jīng)選育的大黃魚, 平均體質(zhì)量 6.67 g±1.8 g, 體長(zhǎng)7.33 cm±0.69 cm, 在室內(nèi)暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。暫養(yǎng)期間, 24 h不間斷充氣, 溫度29±1℃,鹽度為 21～22, pH 為 8.1～8.2, 光照為 500～1500 lx,每天換水1/2。

1.1.2 樣品制備

隨機(jī)選取“閩優(yōu) 1號(hào)”和非選育組的實(shí)驗(yàn)大黃魚各10尾, 以丁香酚麻醉。用無菌注射器從尾靜脈取血, 將其血液混合, 置于滅菌的EP管中作為1個(gè)樣品組。一部分抗凝全血處理后用于大黃魚白細(xì)胞吞噬活力的分析; 另一部分不加抗凝劑的全血置于4℃冰箱中靜置4 h, 待其凝血后于4℃離心, 分離血清和血細(xì)胞, 備用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組。

1.1.3 總蛋白含量測(cè)定

蛋白濃度的測(cè)定采用Bradford[7]法。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.1.4 白細(xì)胞吞噬活性檢測(cè)

白細(xì)胞的吞噬能力從吞噬細(xì)胞率和吞噬指數(shù)兩個(gè)方面進(jìn)行測(cè)定和比較, 具體參照 Martello[8]方法測(cè)定。在EP管中加入2 mL51%Percoll細(xì)胞分離液(包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆?；鞈乙?GE Healthcare,17-5445-02), 輕輕滴入1 mL含抗凝劑的血樣, 4℃、320g離心30 min。然后吸取Percoll液面上的白細(xì)胞層, 以HBSS緩沖液離心洗滌3次, 并將所得白細(xì)胞以HBSS稀釋至2×107個(gè)/mL。然后使用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)目的百分比, 確?；罴?xì)胞數(shù)在90%以上。取100 μL濃度為1×107個(gè)/mL白細(xì)胞懸液滴片, 放入濕盒中, 于25 ℃下靜置20 min, 滴加100 μL濃度約為 1×108個(gè)/mL的酵母細(xì)胞懸液(濃度約為白細(xì)胞濃度的10倍), 置于25℃濕盒中孵育。45 min后取出玻片用滅菌生理鹽水沖洗后自然風(fēng)干, 用甲醇固定5 min, 待甲醇全部揮發(fā)后用Gimsa染液染色15～20 min, 再用滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗, 風(fēng)干后置于光鏡下觀察, 記錄吞噬細(xì)胞率及吞噬指數(shù)。

吞噬細(xì)胞率=參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%

吞噬指數(shù)=平均每個(gè)細(xì)胞吞噬的細(xì)菌數(shù)

1.1.5 血清溶菌酶的活性的檢測(cè)

采用 Wilson[9]的方法稍加修改: 溶壁微球菌溶于50 mmoL/L pH為6.2的PBS溶液, 終濃度為1×108個(gè)/mL; 在96孔板中各加入待測(cè)的大黃魚血清10 μL,然后加入200 μL的PBS新鮮稀釋好的菌懸液, 迅速混勻, 30 s后, 于25℃, 570 nm下分別測(cè)定其在0.5 min 時(shí)的光吸收值(A0)和 4.5 min時(shí)的光吸收值(A),每個(gè)樣品重復(fù) 3次, 酶活力以每毫克血清蛋白每分鐘A570值下降0.001為一個(gè)活力單位。

1.1.6 血清殺菌活性檢測(cè)

以大腸桿菌(Escherichia coli)為底物, 參照王雷等[10]使用的方法進(jìn)行測(cè)定。將底物用 50 mmoL/L pH6.2的PBS稀釋大腸桿菌至A570為0.3～0.5; 取3.0 mL該菌懸液與50 μL待測(cè)血清于試管中混勻, 測(cè)定其在570 nm處的光密度值A(chǔ)0, 然后將試管置于37℃水浴保溫30 min, 然后取出立即置于冰浴中10 min以終止反應(yīng), 測(cè)定其保溫后的A值?？咕盍a按下式計(jì)算:Ua= [(A0–A)/A]1/2。

1.1.7 SOD酶活檢測(cè)

大黃魚血清和紅細(xì)胞中的SOD活力測(cè)定采用黃嘌呤氧化酶法。實(shí)驗(yàn)采用超氧化物歧化酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所), 具體操作按照說明書進(jìn)行。

血清中總 SOD酶活力定義: 每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。計(jì)算公式: 總 SOD 活力(U/mg蛋白質(zhì))=(對(duì)照管吸光度–測(cè)定管吸光度)÷對(duì)照管吸光度÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

紅細(xì)胞中SOD酶活力定義: 全血中每克血紅蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位(U)。計(jì)算公式: 紅細(xì)胞中SOD酶活力(U/gHb)=(對(duì)照管吸光度–測(cè)定管吸光度)÷對(duì)照管吸光度÷50%×反應(yīng)液體積×(抽提液總量/測(cè)定抽提液量)×(1 mL/采血量)÷血紅蛋白含量(gHb/mL)

1.1.8 免疫球蛋白和白蛋白含量測(cè)定

血清中免疫球蛋白含量的測(cè)定參考 László的方法[11]。100 μL血漿加入 100 μL 12%的PEG(聚乙二醇),室溫23～25℃, 振蕩孵育2 h, 然后 3 000g離心15 min, 去上清后檢測(cè)蛋白含量。血清白蛋白含量采用溴甲酚綠法, 實(shí)驗(yàn)使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的白蛋白測(cè)試盒按照產(chǎn)品說明書的步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.2 攻毒實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用副溶血弧菌

攻毒實(shí)驗(yàn)所用的副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)為從發(fā)病大黃魚體內(nèi)分離鑒定出的病原菌。菌株接種于含2%NaCl的瓊脂培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)24 h, 用滅菌的0.85%生理鹽水洗脫菌落, 經(jīng)比濁法計(jì)數(shù), 調(diào)整濃度至1×108個(gè)/mL, 用于攻毒實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 攻毒實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取課題組選育的“閩優(yōu) 1號(hào)”和非選育群體大黃魚各120尾, 置于0.5 t養(yǎng)殖桶中在室內(nèi)進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn); 對(duì)每尾實(shí)驗(yàn)魚腹腔注射200 μL(濃度為1×108個(gè)/mL)的副溶血弧菌進(jìn)行感染[12], 并記錄攻毒8 d時(shí)兩個(gè)群體大黃魚的死亡情況, 對(duì)照組注射同等劑量的生理鹽水。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS(15.0)數(shù)據(jù)分析軟件處理, 采用Excel作圖和t-檢驗(yàn)差異分析方法, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞吞噬活性

白細(xì)胞吞噬活性檢測(cè)結(jié)果表明, 非選育群體大黃魚的吞噬細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)為(42±2.488)%, 吞噬指數(shù)為 1.13±0.21; 選育群體大黃魚吞噬細(xì)胞的吞噬百分?jǐn)?shù)為(49±2.67)%, 吞噬指數(shù)為 1.27±0.33; 選育群體的白細(xì)胞吞噬活性及吞噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)略高于非選育群體(圖 1)。

2.2 血清溶菌酶活性及血清殺菌活性測(cè)定

選育群體大黃魚的血清溶菌酶活性為(3.197±0.793)U, 非選育群體大黃魚的血清溶菌酶活性為(0.504±0.065)U, 分析表明選育組大黃魚的血清溶菌酶活性顯著高于非選育組(P＜0.05), 如圖 2A所示。對(duì)兩組大黃魚的血清殺菌活性檢測(cè)結(jié)果如圖2B所示, 選育群體大黃魚的血清殺菌活性為(0.40±0.04)U, 非選育組大黃魚的血清殺菌活性為(0.32±0.03)U, 選育組血清殺菌活性高于對(duì)照組。

2.3 SOD酶活性的差異

圖1 選育群體與非選育群體大黃魚白細(xì)胞吞噬活性Fig. 1 The phagocytosis of leukocytes from large yellow croaker

圖2 選育群體與非選育群體大黃魚血清中溶菌酶及殺菌活性A. 血清溶菌酶活性; B. 血清殺菌活性; *. 選育群體與非選育群體之間存在顯著性差異(P＜0.05)Fig. 2 The lysozyme and bactericidal activity in serum of large yellow croakerA. The lysozyme activity in serum; B. The bactericidal activity in serum; *. Significant difference between two groups (P ＜ 0.05)

選育群體和非選育群體血清與血細(xì)胞中SOD酶活性測(cè)定值分別見圖3A和圖3B。選育群體大黃魚血清中的 SOD 活力為(25.6±0.78)U, 血細(xì)胞中的SOD 活力為(1.23±0.6442)×107U; 非選育群體大黃魚血清中的 SOD 活力為(22.9±1.6)U, 血細(xì)胞中的SOD 活力為(6.72±0.371)×106U。分析顯示, 選育群體血清SOD活力高于非選育群體, 但是未達(dá)到顯著性水平(P＞0.05); 選育群體大黃魚血細(xì)胞中 SOD 活力(1.23×107U)顯著高于對(duì)照組(6.72×106U)(P＜0.05)。

圖3 選育群體與非選育群體大黃魚血清及血細(xì)胞中SOD活力Fig. 3 The SOD activities in serum and blood cells of large yellow croaker

2.4 免疫球蛋白和白蛋白的含量

兩組大黃魚血清免疫球蛋白和白蛋白含量檢測(cè)結(jié)果如圖 4所示。選育組大黃魚的血清白蛋白含量為(1.53±0.01)g/L, 血清免疫球蛋白含量為(0.28±0.01)g/L; 非選育組大黃魚血清白蛋白含量為(1.32±0.011)g/L, 血清中免疫球蛋白含量為(0.40±0.015)g/L; 選育組血清白蛋白含量高于對(duì)照組, 但是免疫球蛋白含量略低于對(duì)照組。

圖4 選育群體與非選育群體大黃魚血清中免疫球蛋白和白蛋白含量Fig. 4 The immunoglobulin and albumin levels in serum of large yellow croaker

2.5 攻毒后大黃魚的累積死亡率

注射生理鹽水的對(duì)照組大黃魚在 8 d之內(nèi)未出現(xiàn)死亡; 采用副溶血弧菌攻毒后, 選育組與非選育組大黃魚都不同程度地出現(xiàn)了紅斑潰瘍、腐爛等癥狀, 到第8天, 非選育組大黃魚累積死亡數(shù)為43尾,累積死亡率為 35.6%, 選育組大黃魚累積死亡數(shù)為37尾, 累積死亡率為30.8%, 選育群體大黃魚存活率高于非選育群體。

3 討論

魚類的免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞和體液免疫因子組成, 是魚體抵抗病原入侵的機(jī)構(gòu), 同時(shí)也是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。近年來, 由于非特異性免疫系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)病原侵襲過程中的快速反應(yīng),而引起了研究者的重視。魚類作為低等脊椎動(dòng)物, 在抵抗入侵病原微生物的過程中, 非特異性免疫防御系統(tǒng)扮演著重要角色, 該系統(tǒng)主要由參與免疫反應(yīng)的血液和體液因子組成, 在眾多的免疫因子中, 白細(xì)胞吞噬活性、溶菌酶、血清殺菌活性、SOD活力等指標(biāo)的高低常被用作衡量魚類免疫力高低的參照指標(biāo)[14-15]。

魚類的白細(xì)胞是非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分, 在宿主防御抵抗微生物感染的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用[16]。在魚類抵御外界病原侵襲的過程中, 它們能被病原微生物的有害產(chǎn)物激活, 并產(chǎn)生更多有效的抗異源微生物因子[13]。迄今, 吞噬細(xì)胞的吞噬或殺傷功能得到了廣泛研究, Chung等[17]研究表明, 魚類的巨噬細(xì)胞具有殺傷細(xì)菌和寄生蟲幼蟲的作用。本研究發(fā)現(xiàn)選育的閩優(yōu) 1號(hào)大黃魚群體白細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)略高于非選育組, 但是差異不顯著(P＞0.05), 需要對(duì)其與抗病力的相關(guān)關(guān)系進(jìn)一步研究并驗(yàn)證, 進(jìn)而指導(dǎo)選育工作。

溶菌酶是一種水解酶, 主要存在于血清和巨噬細(xì)胞中, 它通過水解革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的 β-1,4糖苷鍵而殺滅病原菌, 使魚類獲得相應(yīng)的保護(hù)[18]。因此, 溶菌酶活力與機(jī)體的免疫水平密切相關(guān)。血清中存在多種活性的抗菌肽等殺菌因子, 它們具有抗菌譜廣的特性, 可以殺滅多種病原菌, 特別是在抵御革蘭氏陰性細(xì)菌的感染中具有重要作用。本研究表明, 選育組大黃魚血清溶菌酶活性高于普通選育群體, 推測(cè)溶菌酶殺菌系統(tǒng)在選育組中具有更強(qiáng)的活力。

SOD是機(jī)體內(nèi)非常重要的抗氧化酶, 在清除自由基、防治生物分子損傷等方面有十分重要的作用[19]; 研究還表明, SOD活力與生物機(jī)體的免疫水平密切相關(guān)[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 選育群體大黃魚血細(xì)胞SOD活力顯著高于普通養(yǎng)殖群體, 而血清中SOD活力在2個(gè)群體中沒有顯著差異。迄今, 在真核生物體中發(fā)現(xiàn)的 SOD主要有 3個(gè)類型, 即細(xì)胞型CuZnSOD, 線粒體型MnSOD和胞外SOD[21]。本研究結(jié)果提示可能選育群體血細(xì)胞中存在的細(xì)胞型SOD高于非選育群體, 而血清中的胞外SOD活力差異不明顯, 但是具體機(jī)制還有待于深入研究。

白蛋白由肝臟合成, 其生理功能包括營(yíng)養(yǎng)作用、排除體內(nèi)的有毒物質(zhì)和游離脂肪酸的運(yùn)輸?shù)? 因而在維持機(jī)體健康中起著重要作用[22]。魚類已經(jīng)具備了初級(jí)特異性免疫系統(tǒng), 其中, 免疫球蛋白由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生, 在魚類疾病防御方面尤其是特異性免疫過程中有重要作用。Siwicki等[23]首次將血清中免疫球蛋白含量作為評(píng)價(jià)魚類免疫功能的指標(biāo)。另外,Adham等[24]以血清蛋白、白蛋白和免疫球蛋白的含量變化作為檢測(cè)環(huán)境對(duì)魚類健康影響的免疫指標(biāo)。Rehulka等[25]研究表明, 血漿白蛋白的含量水平在一定程度上可以作為健康魚體的良好生理狀態(tài)的一個(gè)很好的指標(biāo)。本研究顯示, 無論是選育組還是非選育組, 白蛋白都是血清總蛋白的主要成分, 與金頭鯛(Sparus aurata)中的研究結(jié)果類似[26]。推測(cè)在正常狀態(tài)下, 白蛋白對(duì)于大黃魚維持健康狀態(tài)可能起著非常重要的作用。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)選育組大黃魚免疫球蛋白含量低于普通養(yǎng)殖群體, 由于免疫球蛋白的形成通常是機(jī)體感病幾周后才能形成, 本研究結(jié)果是否暗示對(duì)照組在試驗(yàn)之前曾經(jīng)受到病原體感染導(dǎo)致？還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

副溶血弧菌攻毒后, 對(duì)選育大黃魚和普通養(yǎng)殖群體的死亡率觀察表明, 選育組在8 d內(nèi)的累積死亡率明顯低于非選育群體。同時(shí), 選育群體較高的血清溶菌酶活性及血細(xì)胞SOD活力同樣支持攻毒實(shí)驗(yàn)的累積死亡率的結(jié)果。所以, 作者推測(cè)選育組較低的累積死亡率與機(jī)體的非特異性免疫力可能更為密切, 這也與Anderson[27]的研究結(jié)果相似。推測(cè)非特異性免疫力在魚類的抗病免疫的初期發(fā)揮著更重要的作用。

本研究通過對(duì)選育群體及普通養(yǎng)殖群體大黃魚部分重要免疫因子進(jìn)行比較與分析, 結(jié)果表明, 選育大黃魚的非特異性免疫力普遍高于普通養(yǎng)殖群體,病原菌感染后短期內(nèi)的死亡率低于對(duì)照組, 而特異性免疫指標(biāo)低于對(duì)照組, 提示與特異性免疫相比,非特異性免疫在魚類防病、抗病的初期可能起著重要作用, 為魚類育種工作的深入開展提供了一定理論依據(jù), 但是人工感染后大黃魚的死亡率與免疫指標(biāo)之間的相關(guān)關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

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