三種海洋浮游微藻的分子鑒定及培養(yǎng)條件研究

徐 娜, 逄少軍

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院 研究生院, 北京100049)

浮游微藻是海洋中最主要的初級(jí)生產(chǎn)者, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用。一些微藻能夠引發(fā)赤潮, 給水產(chǎn)養(yǎng)殖、人類健康和海洋環(huán)境都造成巨大負(fù)面影響。很多海洋微藻是水產(chǎn)動(dòng)物開(kāi)口餌料, 或者活性物質(zhì)、生物能源等研究的基礎(chǔ)生物材料[1]。微藻的傳統(tǒng)鑒定主要是依靠形態(tài)特征, 但對(duì)于一些個(gè)體微小或形態(tài)多變的種類, 需借助電子顯微鏡。電鏡觀察受設(shè)備條件的限制, 而且電鏡樣品處理復(fù)雜, 廣泛使用有一定的難度。另外, 在微藻分類中存在很多同物異名的現(xiàn)象, 例如卡羅藻Karlodinium vene fi cum就有Gymnodinium galatheanum,Karlodinium micrum等多個(gè)名稱[2-3]。目前的微藻鑒定和命名存在欠缺準(zhǔn)確性、具有主觀性等問(wèn)題, 在國(guó)內(nèi), 不同研究者對(duì)一些拉丁文名稱的翻譯也不一致。隨著對(duì)生物鑒定研究的深入, 很多物種的命名已發(fā)生改變, 而大多分類參考書目因年代較早而沒(méi)有囊括這些更新的物種。分子生物學(xué)方法對(duì)藻種的鑒定不受條件及環(huán)境因素限制, 是一種準(zhǔn)確、客觀、高效的方法。Genbank收錄了大量生物分子序列, 而且數(shù)量在不斷快速增加,為研究系統(tǒng)進(jìn)化及物種鑒定提供了重要參考。核糖體18S rDNA和ITS序列是藻類分子鑒定和分類中最常用的兩個(gè)分子指標(biāo)[4]。

在持續(xù)建立我國(guó)近海浮游單細(xì)胞海藻活體種質(zhì)庫(kù)的過(guò)程中, 人們需要對(duì)其中的一些重要物種建立豐富培養(yǎng)的條件, 同時(shí)準(zhǔn)確無(wú)誤地完成相關(guān)生物學(xué)鑒定。本文報(bào)道了作者通過(guò)使用兩種分子標(biāo)記序列對(duì)三種新分離的單細(xì)胞海藻進(jìn)行鑒定和培養(yǎng)條件研究的結(jié)果。研究表明這三種藻都是能夠引發(fā)赤潮的海藻物種。研究它們?cè)诓煌h(huán)境條件下的生長(zhǎng)潛力,對(duì)揭示其在自然界大規(guī)模暴發(fā)的機(jī)制有重要參考意義。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)所采用的使用光密度(optical density)來(lái)檢測(cè)海藻生物量變化的研究方法在國(guó)際上被廣泛采用[5-10]。這種方法是利用微藻在某一波長(zhǎng)下的光吸收值來(lái)間接評(píng)價(jià)細(xì)胞密度的變化, 并以此作為衡量藻生物量的指標(biāo)。相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法, 光密度法具有簡(jiǎn)單快速、客觀準(zhǔn)確、不傷害實(shí)驗(yàn)材料等優(yōu)點(diǎn)[11-13]。

1 材料與方法

1.1 藻種的來(lái)源及分離方法

藻種Mbccc-Gym-1、HH200907-1和HH200907-2由北黃海水樣中分離得到。采回的水樣加入滅菌海水配制的f/2培養(yǎng)液[14-15](不添加硅酸鹽)進(jìn)行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為20℃, 以白熾燈為光源, 光照強(qiáng)度為3 000 lx, 光照周期12L : 12D。定期檢查富集培養(yǎng)藻液的細(xì)胞密度。約一周后進(jìn)行藻種分離, 將藻液逐漸稀釋直到一滴(約1μL)平均只含有一個(gè)藻細(xì)胞, 在顯微鏡下檢查, 把只含一個(gè)藻細(xì)胞的水滴轉(zhuǎn)移至24孔組織培養(yǎng)板中, 加入f/2培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。得到純的藻種后轉(zhuǎn)移到三角瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2 藻種的鑒定

1.2.1 形態(tài)的顯微觀察

取純培養(yǎng)的藻液直接置于倒置顯微鏡下(江南XD-202, 中國(guó))觀察活體藻細(xì)胞。另取少量藻液固定后用正置顯微鏡(Nikon E100, 日本)的油鏡觀察并拍照(Canon EOS 1000D, 日本)。掃描電鏡樣品制備:將藻細(xì)胞抽濾到濾膜上, 用2.5%戊二醛溶液固定1 h;之后用 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液洗滌 3次; 依次在30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇中各脫水10 min, 100%的乙醇2×10 min; 隨后先用乙醇: 醋酸異戊酯(1 : 1)置換10 min, 再用100%的醋酸異戊酯20 min; 樣品在臨界點(diǎn)干燥并噴金, 用掃描電子顯微鏡(KYKY-2800B, 中國(guó))觀察拍照。

1.2.2 分子鑒定

取50 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的純種藻液, 7 000g離心5 min, 棄上清收集藻細(xì)胞。用植物試劑盒提取基因組DNA。

18S rDNA序列的擴(kuò)增采用真核生物18S通用引物 SSU-F/ SSU-R[16]。擴(kuò)增藻種 Mbccc-Gym-1和HH200907-1所用的 ITS序列引物為 ITS1/ITS2[4];HH200907-2的ITS序列引物為ITS4/ ITS5[17]。PCR反應(yīng)體積50 μL, 體系包括: 模板基因組DNA 2.5 μL,引物(20 μmol/L)各 1 μL, Taq 酶預(yù)混合的 PCR 反應(yīng)液(Takara, 日本)25 μL, 補(bǔ)充 ddH2O 至 50 μL。18S 序列擴(kuò)增循環(huán)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性10min; 之后94℃變性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸90s, 循環(huán)32次; 最后 72℃延伸10 min[16]。Mbccc-Gym-1和HH200907-1的 ITS序列擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃預(yù)變性 5 min; 之后94℃1 min, 55℃1 min, 72℃2 min, 循環(huán) 30次后 72℃延伸5 min[4]。擴(kuò)增HH200907-2 ITS序列的程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min; 之后94℃1 min, 45℃1 min, 72℃1 min, 循環(huán)25次, 最后72℃延伸5 min[17]。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收目標(biāo)片段, 連接到 pMD18-T 載體, 并轉(zhuǎn)化感受態(tài)Escherichia coliDH-5α, 用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆。用菌液 PCR檢測(cè)白斑菌落, 重組成功的菌落擴(kuò)增培養(yǎng)后送至上海博尚測(cè)序公司測(cè)序。

將測(cè)得的序列在NCBI用BLAST進(jìn)行同源檢測(cè),找出與其最相近的物種。在 Genbank下載相關(guān)物種的18S rDNA序列及ITS序列, 與測(cè)得的序列一起用BioEdit軟件的Clustal W[18]進(jìn)行多序列對(duì)位分析。用MEGA 4[19]的 Kimura 2-parameter 模型計(jì)算遺傳距離, 采用鄰接法(neighbor-joining/ NJ)[20]構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 用自舉分析(bootstrap)[21]估計(jì)系統(tǒng)樹(shù)分支節(jié)點(diǎn)的置信度, 自舉數(shù)據(jù)集為1000次。

1.3 培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)

以藻液在680 nm下的光密度值(A680)為參數(shù)衡量藻體生物量。為檢驗(yàn)A680與藻密度的相關(guān)性, 分別對(duì)三種藻不同密度的藻液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并測(cè)量A680, 計(jì)算藻液密度–A680標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)。光密度值由T6紫外分光光度計(jì)(普析通用, 中國(guó))測(cè)得。藻液初始濃度合適時(shí)接種于100 mL三角瓶, 分別進(jìn)行6組單因素實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3個(gè)樣本, 置于人工培養(yǎng)箱(江南, 中國(guó))中培養(yǎng), 每天搖瓶2次。每隔一天測(cè)量藻液的A680。

表1列出了 6組實(shí)驗(yàn)的條件。每組實(shí)驗(yàn)只有所列條件不同, 其他條件均一致。在實(shí)驗(yàn)1中, 藻液生長(zhǎng)條件為溫度15～28℃, 光照強(qiáng)度5 000 lx, 光照周期為12L : 12D。實(shí)驗(yàn)2中藻液生長(zhǎng)條件為溫度22℃,光照強(qiáng)度1 500～10 000 lx, 光照周期12L : 12D。實(shí)驗(yàn)3條件為溫度22℃, 光照強(qiáng)度5 000 lx, 光照周期分別為8L : 16D、12L : 12D和16L : 8D。實(shí)驗(yàn)1～3所用培養(yǎng)液都是標(biāo)準(zhǔn)f/2培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)4用鹽度為1～36的 f/2培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn) 5培養(yǎng)液中氮(N)濃度為0N～3N, 0N代表培養(yǎng)液不添加氮營(yíng)養(yǎng)鹽, 1N等于標(biāo)準(zhǔn)f/2培養(yǎng)液中的氮濃度(882 μmol/L), N/2等于其一半的濃度, 2N和3N分別代表標(biāo)準(zhǔn)濃度的2和3倍。實(shí)驗(yàn)6培養(yǎng)液的磷(P-)濃度為0P～3P, 0P代表培養(yǎng)液不添加磷營(yíng)養(yǎng)鹽, 1P等于標(biāo)準(zhǔn)f/2培養(yǎng)液的磷濃度(36.2 μmol/L), P/2等于其一半的濃度, 2P和3P分別代表標(biāo)準(zhǔn)濃度的2和3倍。在實(shí)驗(yàn)4～6中, 其他培養(yǎng)條件為溫度20℃, 光照強(qiáng)度5 000 lx, 光照周期12L : 12D。

表1 6組培養(yǎng)條件實(shí)驗(yàn)Tab. 1 Information of 6 batch culture experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

2.1.1 Mbccc-Gym-1

生長(zhǎng)狀態(tài)良好的藻液呈黃褐色。在顯微鏡下觀察, 藻細(xì)胞橫溝明顯, 將細(xì)胞分為大小不等的上下兩部分(圖1a, b)。細(xì)胞旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), 活躍的游動(dòng)細(xì)胞長(zhǎng)8～15 μm, 寬 5～12 μm, 鞭毛 2 條。細(xì)胞易變形, 藻液中加入固定液后細(xì)胞很快變成球形。

圖1 Mbccc-Gym-1的形態(tài)特征Fig. 1 Morphological features of strain Mbccc-Gym-1

2.1.2 HH200907-1

藻液黃褐色。藻細(xì)胞梨形, 被橫溝分為上下兩部分, 上錐部尖, 下錐部半球形。細(xì)胞長(zhǎng) 15～30 μm,寬13～25 μm(圖2a)。細(xì)胞前端伸出兩條不等長(zhǎng)的鞭毛。掃描電鏡照片可看到明顯的橫溝和縱溝(圖2b)。藻體細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)匱乏或條件不適宜時(shí), 會(huì)形成孢囊。孢囊個(gè)體較大, 近球形, 表面具尖刺狀或不規(guī)則的突起(圖 2c)。

2.1.3 HH200907-2

藻液呈黃褐色至褐色。藻細(xì)胞一般為橢圓形, 長(zhǎng)13～20 μm, 寬 7～13 μm(圖 3a,b)。細(xì)胞一側(cè)近體長(zhǎng)1/3處有一短凹陷, 此處伸出兩條不等長(zhǎng)的鞭毛。細(xì)胞核明顯。無(wú)細(xì)胞壁, 細(xì)胞形狀易變化。當(dāng)藻體被轉(zhuǎn)移至淡水中或加入固定液后, 細(xì)胞膜很快破裂, 可明顯看到十幾個(gè)黃綠色的葉綠體(圖3c)。

2.2 分子鑒定: 18S rDNA及ITS序列分析

2.2.1 Mbccc-Gym-1

Mbccc-Gym-1的18S rDNA去除引物后序列長(zhǎng)度為 1742 bp, 提交至 Genbank獲得序列號(hào)JQ320136。ITS序列去除引物后長(zhǎng)度為 613bp(Genbank索引號(hào): JQ320137)。兩條序列分別經(jīng)BLASTn進(jìn)行在線檢索, 與之相似性得分最高的物種都是共生甲藻屬(Symbiodinium)。將18S rDNA序列與Genbank中的相似序列用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖 4)表明, Mbccc-Gym-1和幾株Symbiodiniumsp.、S. microadriaticum、S. californium、Dinophyceae sp. CCMP421(實(shí)為共生甲藻屬[22])完全聚在一起, 支持率為 100%。依據(jù) ITS序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)(圖 5)結(jié)果相似, Mbccc-Gym-1與幾株共生甲藻Symbiodiniumsp.、S. microadriaticum、S. californium和裸甲藻Gymnodiniumsp.聚為單獨(dú)的一支, 支持率為100%。經(jīng)查閱, Genbank收錄的這幾株裸甲藻Gymnodiniumsp.實(shí)際也都為共生甲藻。因此, 根據(jù)這兩條序列的分析結(jié)果, 這株藻應(yīng)該為共生甲藻屬, 但是由于該屬內(nèi)種間差異較小, 這兩種序列都不能很好地區(qū)分開(kāi)不同種, 且 Genbank中與這株藻相近的生物大多未定名到種, 故暫不能對(duì) Mbccc-Gym-1的種名作出判斷, 只推斷為一種可以獨(dú)立生活的共生甲藻Symbiodiniumsp.。

圖2 HH200907-1的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological features of strain HH200907-1

圖3 HH200907-2的形態(tài)特征Fig. 3 Morphological features of strain HH200907-2

圖4 依據(jù)18S rDNA序列通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense為外類群Fig. 4 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node. Alexandrium tamarense is used as outgroup

圖5 依據(jù)ITS序列通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense為外類群Fig. 5 The neighbor-joining tree of ITS sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

2.2.2 HH200907-1

HH200907-1的18S rDNA序列去引物后長(zhǎng)度為1744bp, 提交至Genbank獲得序列號(hào)JQ246506。ITS序列去除引物后長(zhǎng)度為 601bp, Genbank序列號(hào)JQ250798。將兩個(gè)序列經(jīng)BLASTn進(jìn)行在線檢索, 都與Scrippsiella trochoidea(錐狀斯氏藻)相似性得分最高。依據(jù)18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(圖 6)表明, 該藻與Genbank收錄的幾株S. trochoidea聚在一起, 支持率 85%。ITS序列系統(tǒng)樹(shù)(圖 7)中, 幾株S. trochoidea沒(méi)有形成單獨(dú)的一支, 有一定的種內(nèi)差異, 但HH200907-1與大多數(shù)的S. trochoidea聚在一起。因此,作者認(rèn)為這株藻應(yīng)該是錐狀斯氏藻S. trochoidea。

圖6 依據(jù)18S rDNA序列通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense(塔瑪亞歷山大藻)為外類群Fig. 6 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node. Alexandrium tamarense is used as outgroup

圖7 依據(jù)ITS序列通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值), 以Alexandrium tamarense為外類群Fig. 7 The neighbor-joining tree of ITS sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

2.2.3 HH200907-2

HH200907-2的18S rDNA序列去除引物后長(zhǎng)度為1751bp, Genbank序列索引號(hào)JQ250796。ITS序列去引物長(zhǎng)度為610bp, Genbank序列號(hào)JQ250797。將兩個(gè)序列經(jīng) BLASTn進(jìn)行在線檢索, 都與Heterosigma akashiwo(赤潮異彎藻)相似性得分最高。依據(jù) 18S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(圖 8)表明, 該藻與Genbank收錄的幾株H. akashiwo聚在一起, 支持率100%。ITS序列系統(tǒng)樹(shù)(圖9)中, HH200907-2同樣以100%的支持率與H. akashiwo聚為一支。因此, 作者推斷這株藻應(yīng)該為赤潮異彎藻H. akashiwo。

2.3 三種藻的生長(zhǎng)條件

2.3.1A680-細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線

三種藻的A680-細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 10)相關(guān)系數(shù)(R2)都大于0.99。作者檢驗(yàn)了三種藻在不同培養(yǎng)條件下的細(xì)胞密度和A680值, 與標(biāo)準(zhǔn)曲線吻合良好, 表明在680nm測(cè)得的三種藻的A值都可以用來(lái)代表細(xì)胞密度。

2.3.2 共生甲藻

圖11a表明, 共生甲藻在19～28℃生長(zhǎng)良好, 在15℃低溫時(shí)生長(zhǎng)較緩慢; 低光照強(qiáng)度時(shí)(1 500 lx)生長(zhǎng)受限, 4000～10 000 lx條件下, 其生長(zhǎng)速度接近(圖 11b); 延長(zhǎng)光照時(shí)間能促進(jìn)其生長(zhǎng), 但影響不大(圖 11c); 淡水中藻體無(wú)法存活, 在低鹽度(15)中生長(zhǎng)也受限制, 在鹽度大于20的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)無(wú)顯著差異(圖 11d); 培養(yǎng)液中氮濃度對(duì)其生長(zhǎng)影響較大,不額外添加氮營(yíng)養(yǎng)鹽時(shí), 藻體繁殖受限, 氮濃度越高, 藻密度越高(圖 11e); 培養(yǎng)液中低磷濃度也影響其生長(zhǎng), 但磷濃度高于1P(36.2 μmol/L)時(shí), 生物量增長(zhǎng)一致(圖11f)。

2.3.3 錐狀斯氏藻

錐狀斯氏藻在 28℃高溫時(shí)生長(zhǎng)受到限制, 19～22℃生長(zhǎng)最好(圖12a); 1 500 lx的低光照強(qiáng)度限制其生長(zhǎng), 在4 000 lx的光照下開(kāi)始生長(zhǎng)雖較慢, 但最終能達(dá)到較高的生物量(圖 12b); 短的光照時(shí)間(8L:16D)下, 藻體密度開(kāi)始上升較慢, 但最終生物量最高, 長(zhǎng)光照時(shí)間下的藻體最初生長(zhǎng)最快, 但最早進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期(圖 12c); 圖 12d表明藻體在淡水中無(wú)法存活, 鹽度為15～25時(shí)生長(zhǎng)最好; 圖12e中, 低氮濃度的培養(yǎng)液不利于藻體的生長(zhǎng), 在氮濃度為 2N(1 764 μmol/L)和 3N(2 646 μmol/L)時(shí), 最終獲得的生物量最大; 培養(yǎng)液不添加磷營(yíng)養(yǎng)鹽可維持藻體緩慢增長(zhǎng), 磷濃度高于 P/2(即 18.1 μmol/L)時(shí), 對(duì)其生長(zhǎng)影響差別不大(圖12f)。

圖8 依據(jù)18S rDNA序列通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值), 以Fibrocapsa japonica為外類群Fig. 8 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node. Fibrocapsa japonica is used as outgroup

圖9 依據(jù)ITS序列通過(guò)鄰接法(NJ)構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(重復(fù)1000次計(jì)算bootstrap值), 以Fibrocapsa japonica為外類群Fig. 9 The neighbor-joining tree of ITS sequence. Bootstrap values (%)of 1000 replicates are given adjacent to each node.Fibrocapsa japonica is used as outgroup

圖10 三種藻的A680-細(xì)胞密度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 10 The relationship between A680and cell density of three microalgae

圖11 共生甲藻在不同溫度(a)、光照強(qiáng)度(b)、光周期(c)、培養(yǎng)液鹽度(d)、氮濃度(e)、磷濃度(f)下的生長(zhǎng)曲線Fig. 11 Increases of algal biomass of Symbiodinium sp. as determined by A values at different temperatures (a), under different light intensities (b), in different photoperiods (c), in mediums with varied salinities (d), nitrogen (e)and phosphorus (f)levels. Vertical bars represent standard deviations.

圖12 錐狀斯氏藻在不同溫度(a)、光照強(qiáng)度(b)、光周期(c)、培養(yǎng)液鹽度(d)、氮濃度(e)、磷濃度(f)下的生長(zhǎng)曲線Fig. 12 Increases of algal biomass of Scrippsiella trochoidea as determined by A values at different temperatures (a), under different light intensities (b), in different photoperiods (c), in mediums with varied salinities (d), nitrogen (e)and phosphorus (f)levels. Vertical bars represent standard deviations

2.3.4 赤潮異彎藻

該藻在不同溫度下生長(zhǎng)趨勢(shì)一致, 最適溫度為22℃, 低溫(15℃)和高溫(28℃)條件下生長(zhǎng)稍差(圖 13a);光照強(qiáng)度較低(1 500 lx)時(shí), 藻體生長(zhǎng)明顯受限, 光強(qiáng)高于4 000 lx對(duì)其影響不明顯(圖13b); 不同的光周期對(duì)它的生長(zhǎng)稍有影響, 適當(dāng)延長(zhǎng)光照時(shí)間能增大生物量(圖13c); 在淡水中該藻不能存活, 鹽度為15～36的培養(yǎng)液對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響(圖 13d); 未添加氮營(yíng)養(yǎng)鹽的培養(yǎng)液中, 藻體生長(zhǎng)受限, 氮濃度高于 1N(即 882 μmol/L)時(shí), 生長(zhǎng)狀況一致, 生物量最高(圖 13e); 培養(yǎng)液不添加磷營(yíng)養(yǎng)鹽也限制藻的生長(zhǎng), P/2(18.1 μmol/L)的磷濃度足夠滿足其快速生長(zhǎng)需求(圖13f)。

圖13 赤潮異彎藻在不同溫度(a)、光照強(qiáng)度(b)、光周期(c)、培養(yǎng)液鹽度(d)、氮濃度(e)、磷濃度(f)下的生長(zhǎng)曲線Fig.13 Increases of algal biomass of Heterosigma akashiwo as determined by A values at different temperatures (a), under different light intensities (b), in different photoperiods (c), in mediums with varied salinities (d), nitrogen (e)and phosphorus (f)levels. Vertical bars represent standard deviations

3 討論

3.1 對(duì)三種藻的分子生物學(xué)鑒定方法

本文所研究的這三種藻在形態(tài)上都有其特殊性,非專業(yè)的研究人員對(duì)它們的鑒定有一定困難。分子鑒定作為形態(tài)學(xué)方法的有效補(bǔ)充, 在研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。近兩年作者通過(guò)18S rDNA和ITS兩種序列對(duì)新分離微藻進(jìn)行了分析, 結(jié)果表明這兩種序列的結(jié)合能夠有效鑒定多數(shù)微藻物種。18S rDNA序列相對(duì)保守, 對(duì)屬以上水平的鑒定較為有效;而 ITS區(qū)變異較大, 更適合于作為種水平的分類依據(jù)[4,23]。

在實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期獨(dú)立培養(yǎng)條件下藻種Mbccc-Gym-1生長(zhǎng)良好, 它在形態(tài)上與裸甲藻非常相似, 因此最初被鑒定為裸甲藻(Gymnodiniumsp.)。但是在依據(jù)兩種DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中, 它都與Genbank中的共生甲藻屬(Symbiodinium)聚在一起, 而與裸甲藻屬(Gymnodinium)遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)。自然界中共生甲藻大多與海洋無(wú)脊椎動(dòng)物共生,但有少數(shù)能自由生活[24]。本株藻雖與裸甲藻形態(tài)相似并獨(dú)立生活, 但是作者依據(jù)分子序列分析判斷其應(yīng)為一種能自由生活的共生甲藻(Symbiodiniumsp.)。Wilcox[25]認(rèn)為在共生甲藻中形態(tài)學(xué)特征不能概括系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系, 他根據(jù) SSU rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中, 有兩種自由生活的甲藻出現(xiàn)在共生甲藻類群中,表明這個(gè)類群在進(jìn)化中曾失去其共生的生活方式。美國(guó)國(guó)家海洋藻種保藏中心的一株能自由生活的藻種 CCMP421最初被鑒定為裸甲藻(Gymnodinium varians), 但是后來(lái) rDNA分子進(jìn)化研究表明這株藻應(yīng)該為共生甲藻屬(Symbiodinium), 自由生活的共生甲藻可能代表共生甲藻屬中的一個(gè)亞屬[26]。研究者對(duì)水體中分離得到的自由生活的共生藻有不同看法,有人認(rèn)為是底棲共生藻遷移到水體尋找新的宿主,也有人認(rèn)為它們不能共生只能自由生活[27-29]。陳國(guó)福等[24]認(rèn)為這種藻有引發(fā)赤潮的可能。

錐狀斯氏藻(S. trochoidea)是一種常見(jiàn)的世界廣布性赤潮藻, 由其引發(fā)的赤潮在挪威、美國(guó)、智利、羅馬尼亞、日本等國(guó)家都有過(guò)報(bào)道, 也是我國(guó)沿海特別是南海海域常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)甲藻[30]。錐狀斯氏藻在其生活史的某一時(shí)期, 能夠形成孢囊來(lái)抵御不良環(huán)境。孢囊也被普遍認(rèn)為是赤潮發(fā)生的“種源”, 對(duì)赤潮的發(fā)生、延續(xù)和消亡過(guò)程有著重要的作用[31]。孢囊形態(tài)多樣, 王艷等[32]觀察到錐狀斯氏藻可形成 4種形態(tài)的休眠孢囊, 并且與營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)差別較大。因此在對(duì)錐狀斯氏藻尤其孢囊形態(tài)的藻體鑒定時(shí), 經(jīng)驗(yàn)不足的工作人員僅僅依靠形態(tài)觀察往往不能夠完成準(zhǔn)確鑒定, 而分子鑒定可排除這種影響。

赤潮異彎藻(H. akashiwo)也是一種常見(jiàn)的赤潮藻, 能夠產(chǎn)生毒素, 在很多國(guó)家曾大量暴發(fā)并導(dǎo)致魚類大量死亡[33]。由于培養(yǎng)條件或細(xì)胞周期的不同,細(xì)胞可呈現(xiàn)球形、卵形或橢圓形等多種形態(tài)[34]。另一方面, 赤潮異彎藻沒(méi)有細(xì)胞壁, 細(xì)胞維持其滲透壓的能力較差, 因此在對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察時(shí), 細(xì)胞經(jīng)常因固定而破裂或變形[35]。作者也在研究中發(fā)現(xiàn),藻樣中加入微量固定液后, 細(xì)胞游動(dòng)減慢并停止,一旦停止游動(dòng), 細(xì)胞膜便開(kāi)始破裂, 只有在細(xì)胞剛停止游動(dòng)但細(xì)胞膜暫未破裂的半分鐘內(nèi)才能抓拍到其完整形態(tài)的照片, 而想要得到細(xì)胞完整形態(tài)的電鏡照片則更加困難。在國(guó)內(nèi)外研究中, 這種藻經(jīng)常被誤認(rèn)為是金色滑盤藻(Olisthodiscus luteus)[36]。對(duì)這種形態(tài)容易變化的微藻, 依靠分子生物學(xué)方法對(duì)其鑒定, 可得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)論。

3.2 培養(yǎng)條件對(duì)三種藻的影響

對(duì)三種藻的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): (1)三種藻都在 22℃的條件下生長(zhǎng)最好, 大多數(shù)浮游微藻生長(zhǎng)的最適溫度都在 22℃左右[37-40], 并且在我國(guó)赤潮頻發(fā)時(shí)段為5～8月[41], 20℃左右的水溫也最利于赤潮藻類的大量繁殖; 高溫和低溫對(duì)三種藻的影響不同: 共生甲藻不耐低溫, 錐狀斯氏藻在高溫下生長(zhǎng)受限, 赤潮異彎藻適溫范圍較廣。(2)光照對(duì)它們影響相似, 三種藻在弱光時(shí)生長(zhǎng)都受限, 大于4 000 lx的光照強(qiáng)度是它們快速增長(zhǎng)的必要條件, 不同的是共生甲藻和赤潮異彎藻在光照越強(qiáng)時(shí)生長(zhǎng)越好, 而錐狀斯氏藻在強(qiáng)光下最初幾天生長(zhǎng)最快但第五天開(kāi)始生物量明顯下降; 延長(zhǎng)光照時(shí)間對(duì)藻體生長(zhǎng)繁殖起促進(jìn)作用,但錐狀斯氏藻在短光照時(shí)間下雖最初生長(zhǎng)緩慢, 但最終生物量最高。(3)三種藻在鹽度大于15的海水中都能存活, 適鹽范圍都較廣, 在自然界中沿海淡水流入或降雨而導(dǎo)致的海水鹽度的微量變化不會(huì)影響它們的生長(zhǎng), 因而赤潮可在近岸暴發(fā)。(4)海水中氮磷濃度對(duì)三種藻的生長(zhǎng)都有重要的影響, 表現(xiàn)在低濃度限制生長(zhǎng), 高濃度促進(jìn)生長(zhǎng), 但高到一定程度后, 氮磷濃度的增加不會(huì)再對(duì)藻生物量的增加產(chǎn)生影響, 用f/2培養(yǎng)液可基本滿足藻體快速生長(zhǎng)的氮磷需求。在室內(nèi)對(duì)大多數(shù)浮游微藻的常規(guī)培養(yǎng)可采用溫度20～22℃, 10 000 lx光照12h的條件, 用f/2培養(yǎng)液培養(yǎng)。

本研究對(duì)三種藻培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)周期為10～12d, 一直持續(xù)到藻體生長(zhǎng)的平穩(wěn)期或衰退期。在研究中發(fā)現(xiàn)某些條件下微藻雖在指數(shù)期生長(zhǎng)最快, 但是最早進(jìn)入穩(wěn)定期, 最終生物量可能低于其他條件下的樣品, 因此在微藻培養(yǎng)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要提供最合適的條件。例如對(duì)于錐狀斯氏藻, 若要獲得高生物量,在連續(xù)培養(yǎng)時(shí)應(yīng)當(dāng)提供高光和長(zhǎng)時(shí)間光照; 在一次性培養(yǎng)時(shí), 光照強(qiáng)度和時(shí)間可適當(dāng)減弱。

[1]鄒樹(shù)平, 吳玉龍, 楊明德, 等. 微藻的綜合開(kāi)發(fā)利用[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2007, 26(3): 179-181.

[2]Bergholtz T, Daugbjerg N, Moestrup ?, et al. On the identity ofKarlodinium veneficumand description ofKarlodinium armigersp. nov. (Dinophyceae), based on light and electron microscopy, nuclear-encoded LSU rDNA, and pigment composition [J].J Phycol, 2005, 42:170-193.

[3]Daugbjerg N, Hansen G, Larsen J, et al. Phylogeny of some of the major genera of dinoflagellates based on ultrastructure and partial LSU rDNA sequence data, including the erection of three new genera of unarmoured dinoflagellates [J].Phycologia, 2000, 39 (4): 302-317.

[4]羅立明, 胡鴻鈞, 李夜光, 等. 東海原甲藻的分子鑒定[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2006, 28(1): 127-131.

[5]Tang J X, Hoagland K D, Siegfried B D. Differential toxicity of atrazine to selected freshwater algae[J]. Bull Environ Contam Toxicol, 1997, 59: 631-637.

[6]Ma J, Lin F, Zhang R, et al. Differential sensitivity of two green algae,Scenedesmus quadricaudaandChlorella vulgaris, to 14 pesticide adjuvants[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004, 58: 61-67.

[7]Liang W Y, Qu J H, Chen L B, et al. Inactivation ofMicrocystis aeruginosaby continuous electrochemical cycling process in tube using Ti/RuO2electrodes[J].Environ Sci Technol, 2005, 39: 4633-4639.

[8]Danger M, Leflaive J, Oumarou C, et al. Control of phytoplankton bacteria interactions by stoichiometric constraints[J]. Oikos, 2007, 116: 1079-1086.

[9]Danger M, Oumarou C, Benest D, et al. Bacteria can control stoichiometry and nutrient limitation of phytoplankton[J]. Functional Ecology, 2007, 21: 202-210.

[10]Chen M, Tang H, Ma H, et al. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algaeDunaliella tertiolecta[J]. Bioresource Technology, 2011,102: 1649-1655.

[11]Persoone G. Development and fi rst validation of a“stock-culture free” algal microbiotest: The Algaltoxkit[C]//Wells P G, Lee K, Blaise C. Microscale aquatic toxicology, advances, techniques and practice.USA: CRC Press, 1998: 311-320.

[12]沈萍萍, 王朝暉, 齊雨藻, 等. 光密度法測(cè)定微藻生物量[J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版), 2001,22(3): 115-119.

[13]黃美玲, 何慶, 黃建榮, 等. 小球藻生物量的快速測(cè)定技術(shù)研究[J]. 河北漁業(yè), 2010, 4: 1-3.

[14]Guillard R R L, Ryther J H. Studies of marine planktonic diatoms. I.Cyclotella nanaHustedt andDetonula confervaceaCleve[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1962, 8(2): 229-239.

[15]Guillard R R L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates[C]//Smith W L, Chanley M H.Culture of Marine Invertebrate Animals. New York:Plenum Press, 1975: 26-60.

[16]王波, 米鐵柱, 呂頌輝, 等. 五種/株原甲藻核糖體小亞基(18S rRNA)基因克隆及序列分析[J]. 海洋與湖沼, 2006, 37(5): 450-456.

[17]Connell L B. Nuclear ITS region of the algaHeterosigma akashiwo(Chromophyta: Raphidophyceae)is identical in isolates from Atlantic and Pacific basins[J].Marine Biology, 2000, 136(6): 953-960.

[18]Thompson J D, Higgins D G and Gibson T J. CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice[J]. Nucleic Acids Research, 1994, 22(22): 4673-4680.

[19]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007,24(8): 1596-1599.

[20]Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution, 1987, 4(4): 406-425.

[21]Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap[J]. Evolution, 1985, 39:783-791.

[22]茍萬(wàn)里, 劉東艷, 甄毓, 等. 利用 rDNA和 ITS序列對(duì) 1株裸甲藻的初步鑒定[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2004, 34(1): 75-83.

[23]鄭俊斌, 張鳳英, 馬凌波, 等. 米氏凱倫藻18S rDNA和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,18(6): 680-685.

[24]陳國(guó)福, 王廣策, 張春云, 等. 一株裸甲藻類似種的形態(tài)和系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 科學(xué)通報(bào), 2008, 53(3):299-305.

[25]Wilcox T P. Large-subunit ribosomal RNA systematics of symbiotic dinoflagellates: morphology does not recapitulate phylogeny[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 1998, 10(3): 436-448.

[26]Pochon X, Montoya-Burgos J I, Stadelmann B, et al.Molecular phylogeny, evolutionary rates, and divergence timing of the symbiotic dinoflagellate genusSymbiodinium[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2006, 38(1): 20-30.

[27]Coffroth M A, Lewis C F, Santos S R, et al. Environmental populations of symbiotic dinoflagellates in the genusSymbiodiniumcan initiate symbioses with reef cni-darians[J]. Current Biology, 2006, 16(23): 985-987.

[28]Littman R A, van Oppen M J H, Willis B L. Methods for sampling free-livingSymbiodinium(zooxanthellae)and their distribution and abundance at Lizard Island(Great Barrier Reef)[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2008, 364(1): 48-53.

[29]朱霞, 甄毓, 于志剛. 一株分離自膠州灣的裸甲藻形態(tài)相似種的分子系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 海洋學(xué)報(bào), 2011,33(1): 153-162.

[30]張玉娟, 曹宇, 王朝暉, 等. N 和 P對(duì)錐狀斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)生長(zhǎng)及孢囊形成的影響[J].海洋環(huán)境科學(xué), 2006, 25(4): 7-10.

[31]黃海燕, 陸斗定. 甲藻孢囊研究進(jìn)展[J]. 海洋學(xué)研究,2009, 27(3): 85-92.

[32]王艷, 熊德甫, 顧海峰, 等. 錐狀施克里普藻孢囊的多種形態(tài)特征[J]. 植物學(xué)報(bào), 2009, 44(6): 701-709.

[33]O’Halloran C, Silver M W, Holman T R, et al.Heterosigma akashiwoin central California waters[J].Harmful Algae, 2006, 5(2): 124-132.

[34]Hara Y and Chihara M. Morphology, ultrastructure and taxonomy of the Raphidophycean algaHeterosigmaakashiwo[J]. Journal of Plant Research, 1987, 100(2):151-163.

[35]周成旭, 汪飛雄, 嚴(yán)小軍. 溫度鹽度和光照條件對(duì)赤潮異彎藻細(xì)胞穩(wěn)定性的影響[J]. 海洋環(huán)境科學(xué), 2008,27(1): 17-19.

[36]顏天, 周名江, 錢培元. 赤潮異彎藻Heterosigma akashiwo的生長(zhǎng)特性[J]. 海洋與湖沼, 2002, 33(2):209-214.

[37]馬志珍, 張繼紅. 新分離出的5種微藻的適宜生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 1998, 17(2): 26-29.

[38]華雪銘, 周洪琪, 丁卓平. 溫度和光照對(duì)微藻的生長(zhǎng),總脂肪含量及脂肪酸組成的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 1999, 8(4): 309-315.

[39]王正方, 張慶, 呂海燕. 溫度、鹽度、光照強(qiáng)度和pH對(duì)海洋原甲藻增長(zhǎng)的效應(yīng)[J]. 海洋與湖沼, 2001,32(1): 15-18.

[40]陳炳章, 王宗靈, 朱明遠(yuǎn), 等. 溫度、鹽度對(duì)具齒原甲藻生長(zhǎng)的影響及其與中肋骨條藻的比較[J]. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2005, 23(1): 60-64.

[41]國(guó)家海洋局. 2009年中國(guó)海洋環(huán)境質(zhì)量公報(bào)[M]. 北京: 海海洋出版社, 2010.