浮游植物葉綠素a含量測定方法的比較及優(yōu)化

張 紅, 呂 富, 呂林蘭, 黃金田

(鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院, 江蘇 鹽城 224003)

浮游植物的種群生物量是水生生態(tài)系統(tǒng)研究的一個重要指標(biāo), 葉綠素 a存在于所有浮游植物體內(nèi),占細(xì)胞干質(zhì)量的 1%～2%, 通?？梢杂脕砜焖俟浪惴N群生物量和浮游植物的增殖能力, 因此浮游植物葉綠素 a含量的測定成為浮游植物生物量的重要指標(biāo)已被廣泛應(yīng)用[1-4]。葉綠素a常用作水體初級生產(chǎn)力的衡量指標(biāo), 在水域環(huán)境生物學(xué)研究及漁業(yè)初級生產(chǎn)力調(diào)查中被廣泛應(yīng)用。

目前, 浮游植物葉綠素 a的測定方法主要有高效液相色譜法、熒光光度計(jì)法和分光光度計(jì)法。分光光度計(jì)法因操作簡單、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)成為了目前普遍使用的測定浮游植物葉綠素a的方法[5-6]。目前國際上仍廣泛使用丙酮作為萃取溶劑的單色法測定浮游植物葉綠素 a的含量, 但從萃取效果和安全性等考慮, 已逐漸采用乙醇作溶劑進(jìn)行萃取。目前已有一些關(guān)于葉綠素 a測定方法的比較, 熱乙醇法測定誤差的探討及方法優(yōu)化等的報(bào)道, 但直接以天然養(yǎng)殖池塘的水樣作為分析對象, 考慮熱乙醇法的各個因素對提取葉綠素 a的影響未見報(bào)道[7-9]。因此, 本研究比較了熱乙醇法和丙酮法, 并利用方差分析優(yōu)化熱乙醇法提取浮游植物葉綠素 a方法中各影響因素的最佳條件, 以期得到更為精確、有效、簡便的測定方法,為快速估算養(yǎng)殖水體種群生物量提供基本依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水樣取自射陽鹽場達(dá)陽養(yǎng)殖區(qū) D13池塘, 該塘約13 ha(200畝), 采用鯽魚為主, 鰱魚為輔的混養(yǎng)模式, 以五點(diǎn)取樣法, 于水面以下0.5～1.0 m采樣。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水樣的處理和保存

根據(jù)金相燦等[1]的“湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)劃”和章宗涉等[10]的“淡水浮游生物研究方法”所述方法, 取300 mL水樣經(jīng)微孔濾膜過濾后, 將帶樣品的濾膜剪碎放入10 mL離心管中于冰箱冷凍室–20℃保存。

1.2.2 熱乙醇萃取分光光度法(乙醇法)步驟

1.2.3 丙酮萃取分光光度法(丙酮法)步驟

根據(jù)金相燦等[1]和章宗涉等[10]所述方法, 取帶樣濾膜剪碎后在研缽中加適量 90%丙酮研磨至足夠細(xì), 移入試管中于暗處靜置萃取 4～10 h后, 離心得清液定容, UV-2100型分光光度計(jì)測定方法同上, 葉綠 素 a 計(jì) 算 公 式 為 : Chla丙酮=27.3×[(E665–E750)–(A665–A750)]×V丙酮/V水樣

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 乙醇法和丙酮法測定比較

在同一水域采 5個平行水樣, 同時用丙酮法和乙醇法測定葉綠素 a含量, 另在 5個不同水域采樣,也用兩種方法測定, 用方差分析F檢驗(yàn)比較結(jié)果。

1.3.2 乙醇-超聲法測定條件優(yōu)化

在乙醇-超聲法處理時, 試驗(yàn)設(shè)置冷凍時間為 0和24 h, 各重復(fù)5次。試驗(yàn)設(shè)置萃取時間依次為2、4、6、8、10 h; 超聲波破碎時間依次為0、1、2、3、4 min; 水浴溫度依次為 50、60、70、80、90 ℃, 以上各重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇法與丙酮法測定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)比較

據(jù)表1結(jié)果, 經(jīng)方差分析F檢驗(yàn),F=20.046大于11.26(F0.01(1.8))。說明兩種方法的測定結(jié)果具極顯著差異, 乙醇法測定結(jié)果顯著高于丙酮法結(jié)果, 說明乙醇法對浮游植物的葉綠素 a萃取較完全。乙醇法測定結(jié)果的方差和標(biāo)準(zhǔn)誤差都低于丙酮法測定結(jié)果,也說明乙醇法帶來的操作誤差較小。

根據(jù)在不同水域樣品的測定結(jié)果, 計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2=0.9990, 說明兩方法存在顯著相關(guān)關(guān)系, 回歸方程為: Chla丙酮=1.0932Chla乙醇–11.677(如圖 1)。

2.2 乙醇-超聲法是否凍融測定結(jié)果的比較

結(jié)果表明, 同一水域的樣品運(yùn)用凍融法測定結(jié)果極顯著高于非凍融法(表2)。經(jīng)SPSS方差分析, 結(jié)果為S冷凍(0.824)>S不冷凍(0.739), 樣品經(jīng)凍融處理后葉綠素a提取率顯著高于非凍融法。

圖1 測定葉綠素a含量的乙醇法和丙酮法結(jié)果相關(guān)關(guān)系Fig. 1 The correlation between hot-ethanol and cool-acetone method for measuring chlorophyll a

表1 乙醇法和丙酮法測定結(jié)果比較Tab. 1 The comparasion between the ethanol and acetone method

表2 凍融對葉綠素a提取的影響Tab 2 Effect of extraction freezing on extraction of chlorophyll a

2.3 乙醇-超聲法萃取時間的比較

如圖2所示, 葉綠素a含量隨萃取時間的增加而增加。萃取時間為10 h時葉綠素a含量最高, 但與6 h和8 h萃取時間相比, 葉綠素a含量沒有顯著差異; 萃取時間為4 h和2 h時, 葉綠素a含量均顯著低于6 h。故考慮萃取6 h為宜。

2.4 乙醇-超聲法超聲波破碎時間的比較

隨超聲波破碎時間的延長, 葉綠素 a含量逐漸增高(圖 3)。超聲波破碎時間為 4 min時達(dá)最高值55.05 μg/L, 與破碎時間3 min相比, 不存在極顯著差異, 但極顯著高于破碎時間2 min及以下結(jié)果。因此, 考慮超聲波破碎3 min為宜。

圖2 萃取時間對葉綠素a提取的影響Fig. 2 Effects of extraction time on extraction of chlorophyll a

圖3 超聲波時間對葉綠素a提取的影響Fig. 3 Effects of ultrasonic time on extraction of chlorophyll a

2.5 乙醇-超聲法熱提取不同水浴溫度的比較

由圖 4可知, 水浴溫度從 50℃增加到 80℃時,葉綠素 a含量也逐步上升, 在水浴溫度為 80℃時葉綠素 a含量達(dá)最高值為 73.64 μg/L, 而水浴溫度90℃時卻突然下降, 且極顯著低于 80℃時的數(shù)值。故考慮最佳水浴溫度為80℃。

圖4 水浴溫度對葉綠素a提取的影響Fig. 4 Effects of water bath temperature on extraction of chlorophyll a

3 結(jié)論與討論

3.1 不同萃取方法的葉綠素a的萃取效率

本實(shí)驗(yàn)對養(yǎng)殖水體的同一水域或不同水域的測定結(jié)果均顯示, 乙醇-超聲波法的萃取效率顯著高于丙酮法。這與楊彩根等[3]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似, 認(rèn)為乙醇-超聲波法明顯優(yōu)于丙酮法。從試驗(yàn)的易操作性分析,丙酮法樣品磨碎費(fèi)工費(fèi)時, 手工研磨細(xì)胞破碎不完全, 不利于大批量樣品的測定。同時, 國內(nèi)生產(chǎn)的醋酸纖維微孔濾膜在丙酮中完全溶解, 對分光光度計(jì)吸收值測定有影響, 也就影響了葉綠素 a質(zhì)量濃度的測定結(jié)果[11-12]。而乙醇法先利用冷處理破碎細(xì)胞,經(jīng)熱乙醇萃取后再利用超聲波進(jìn)一步粉碎細(xì)胞處理,葉綠素 a的萃取較完全。建議在養(yǎng)殖水體監(jiān)測及水環(huán)境監(jiān)測葉綠素a含量領(lǐng)域采用乙醇-超聲波法。

3.2 乙醇-超聲法測定條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)表明, 運(yùn)用乙醇-超聲法測定浮游植物葉綠素a含量時, 應(yīng)將帶樣品的濾膜–20℃冰凍24 h以上, 加適量 80℃熱乙醇在 80℃水浴中解凍, 經(jīng)超聲波破碎機(jī)超聲振蕩處理3 min后, 室溫黑暗條件下萃取6 h, 再離心定容測定。這與趙玉華[13]試驗(yàn)結(jié)果相似, 合適的萃取時間為6～8 h。梁興飛等[9]由正交優(yōu)化試驗(yàn)得出最佳條件為: 萃取溫度 80℃, 萃取時間2 h, 乙醇濃度90%, 超聲波(40W, 20kHz)破碎10 min,并且, 隨著超聲波破碎時間過長, 會造成提取液局部溫度上升, 葉綠素開始降解, 進(jìn)而影響葉綠素含量的測定。

水浴溫度為 80℃, 這與絕大多數(shù)研究結(jié)果相同,當(dāng)水浴溫度達(dá)90℃時, 葉綠素a的值明顯下降, 表明葉綠素因溫度過高而被破壞[14]。另外乙醇的沸點(diǎn)是81℃, 當(dāng)水浴溫度高于 80℃時會使得乙醇部分蒸餾而出, 降低了乙醇的濃度, 影響了熱乙醇的萃取[15]。

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