復(fù)方桑黃顆粒中總黃酮成分提取工藝研究

陳雨微 張紅玉 宋棋芬 徐茂義 黃越燕

嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興 314001

復(fù)方桑黃顆粒中總黃酮成分提取工藝研究

陳雨微 張紅玉 宋棋芬 徐茂義 黃越燕▲

嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興 314001

目的優(yōu)化復(fù)方桑黃顆粒的提取工藝。方法 以正交試驗(yàn)表對(duì)復(fù)方桑黃顆粒中總黃酮成分醇提工藝的影響因素進(jìn)行考察，優(yōu)選工藝條件。 結(jié)果 優(yōu)選提取工藝為20倍量的70%乙醇，回流提取3次，總黃酮提取率為30.29%，出膏率為10.39%。 結(jié)論 該提取工藝條件穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可為復(fù)方桑黃顆粒的大生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

桑葉；總黃酮；提取工藝；正交試驗(yàn)

復(fù)方桑黃顆粒源自臨床驗(yàn)方，是由桑葉、葛根、黃精、百合制成的復(fù)方制劑，具有滋腎潤(rùn)肺、補(bǔ)脾益氣、除煩止渴之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，桑葉黃酮具有降糖、抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌、抗病毒等藥理作用[1-2]，葛根素具有降低血管阻力，改善心腦血液循環(huán)，降血糖、抗氧化等藥理作用[3]。根據(jù)各藥材的有效成分及功能，為最大限度地保留有效成分[4-5]，并依據(jù)適當(dāng)經(jīng)濟(jì)的原則，對(duì)桑葉、葛根采取乙醇回流提取總黃酮類成分，對(duì)黃精、百合水煎煮提取多糖成分，合并制成復(fù)方制劑。為保證制劑質(zhì)量及臨床療效，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)探討復(fù)方桑黃顆粒中總黃酮成分提取工藝，以尋找最佳的提取工藝條件。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；SB-5200型超聲清洗儀（上海必能信）；GM-0.33II型隔膜式真空泵（天津騰達(dá)）；UV-210型紫外分光光度計(jì)（日本島津）；BS110S型電子分析天平（北京賽多利斯）；DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏）。

1.2 試藥

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100080-200708）；桑葉、葛根、黃精、百合，購(gòu)于嘉興嘉信醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》2010年版有關(guān)規(guī)定。乙醇、丙酮、氯仿、甲醇等試劑為分析純，乳糖、可溶性淀粉、糊精等為藥用輔料。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)樣本率進(jìn)行x2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)系數(shù)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交設(shè)計(jì)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知影響提取的主要因素為乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D），為進(jìn)一步優(yōu)選各因素最佳工藝水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，考慮到復(fù)方多成分作用的特點(diǎn)及方中黃酮類化合物的生物特性，選擇浸膏得率與總黃酮提取率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交表優(yōu)選醇提的最佳工藝條件，因素水平設(shè)計(jì)見表1，平行重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)（n=3）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2.2 實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

藥材烘干至恒重，粉碎過(guò)12目篩，按復(fù)方桑黃顆粒處方比例精密稱取桑葉、葛根共20 g，共計(jì)9份，按表1條件進(jìn)行試驗(yàn)。即用相應(yīng)溶劑密閉浸漬30 min，于70℃水浴條件下乙醇回流提取，提取液合并過(guò)濾，濾液于4 ℃冷藏2 h后減壓回收乙醇至無(wú)醇味，水浴濃縮，抽濾，濾液定容于100 mL，搖勻，得1～9號(hào)樣品，待測(cè)。平行操作3遍，共計(jì)27份樣品，按“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)目下操作，測(cè)定總黃酮提取率和浸膏得率，并充分考慮二者關(guān)系及對(duì)真實(shí)結(jié)果的影響，利用總黃酮平均提取率+浸膏平均得率作為綜合加權(quán)評(píng)分，得出綜合評(píng)分，結(jié)果見表2。為進(jìn)一步確定各因素對(duì)結(jié)果的影響大小，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

2.2.1 浸膏得率的測(cè)定 精密量取50 mL的桑葉葛根提取液，置于潔凈干燥并已稱重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置于烘箱內(nèi)105℃干燥3 h，于干燥器內(nèi)冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率，記錄3次平均值。浸膏得率=干膏質(zhì)量/藥材重×100 %。結(jié)果見表2。

2.2.2 總黃酮含量的測(cè)定 （1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.5 mg，加70%乙醇適量使溶解，定容于50 mL容量瓶中，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL于25 mL容量瓶中，補(bǔ)加70%乙醇至6 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液 1 mL，搖勻后放置6 min，加入4 %氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得蘆丁對(duì)照品溶液。以0 mL蘆丁對(duì)照品溶液作空白，在360～600 nm波長(zhǎng)范圍測(cè)定吸光度，選擇吸光度最大的500 nm處，測(cè)定其吸光度。以吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，得Y=0.093 1X-0.002 3（r= 0.996 7）。（3）供試品溶液的測(cè)定：量取少量樣品液以0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，精密吸取50 μl濾液置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇6 mL，按照“2.2.2.2下”加入5 %亞硝酸鈉起相同操作，制得供試品待測(cè)液，于500 nm處測(cè)定供試品中總黃酮的含量，計(jì)算總黃酮平均提取率。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從上述結(jié)果分析可以看出，各因素的影響大小依次為：B＞D＞A＞C。由表3結(jié)果可見，B，D兩因素對(duì)顆粒劑的綜合評(píng)分差異極顯著，A因素呈顯著性差異，而C因素在考察范圍內(nèi)的影響很小。從省時(shí)降耗及生產(chǎn)實(shí)際出發(fā)，在保證提取充分的前提下，綜合分析各個(gè)因素對(duì)總黃酮的提取率和浸膏得率的影響，擬定最佳工藝為：20倍乙醇用量，提取3次，乙醇濃度60%，每次提取2 h。

表4 最佳工藝條件驗(yàn)證結(jié)果

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn) 按照正交試驗(yàn)確定的最佳工藝條件下，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見表4。測(cè)定浸膏平均得率為10.39%，總黃酮平均提取率為30.29%，均高于正交實(shí)驗(yàn)的其余各組數(shù)據(jù)，證明優(yōu)選工藝數(shù)據(jù)可靠。

3 討論

隨著我國(guó)人口老年化和人均生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病人群和高危人群群體越來(lái)越大，中醫(yī)藥在治療糖尿病方面也越來(lái)越受重視。復(fù)方桑黃顆粒由4味藥材組方：桑葉、葛根、黃精、百合均列入我國(guó)衛(wèi)生部公布的藥食同源名錄。原方為湯劑，改制成顆粒劑后，既省去了湯劑臨用時(shí)煎煮的麻煩，又克服了湯劑貯存、攜帶、服用不便的缺點(diǎn)，更適合現(xiàn)代人的用藥需求。

桑葉與葛根是本復(fù)方制劑處方中的重要藥物，其降血糖的主要成分均為黃酮類化合物，因此選擇總黃酮作為其乙醇提取工藝階段的主要考察評(píng)價(jià)指標(biāo)。本試驗(yàn)根據(jù)各藥材的理化性質(zhì)并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選符合工藝實(shí)際的多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，采用綜合權(quán)重評(píng)分法結(jié)合正交設(shè)計(jì)優(yōu)化制備工藝，因此較單指標(biāo)分析的傳統(tǒng)方法更全面、科學(xué)、實(shí)用。方差分析結(jié)果顯示，影響提取極其顯著的因素是乙醇用量、提取次數(shù)，較顯著的因素為乙醇濃度，提取時(shí)間為不顯著因素。經(jīng)過(guò)直觀分析和方差分析，結(jié)果一致，說(shuō)明本研究方法合理，數(shù)據(jù)可靠，結(jié)果可信。

本研究重點(diǎn)討論復(fù)方桑黃顆粒中總黃酮成分的提取工藝，對(duì)于本處方的制備工藝中，多糖類化合物的提取工藝條件的優(yōu)化另行研究及報(bào)道。

[1]原愛紅，馬駿，蔣曉峰.桑葉中糖苷酶抑制活性組分的篩選[J].中國(guó)中藥雜志，2006，2（3）：223-227.

[2]萬(wàn)利秀，肖更生，劉亮 .桑葉中黃酮的研究進(jìn)展 [J].廣東蠶業(yè)，2009，3（30）：44-48.

[3]李健.葛根總黃酮的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（12）：1117-1118.

[4]劉利，潘一樂(lè).春秋桑葉總黃酮含量分析及提取工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2009，30（4）：72-75.

[5]甘琳，周芳，張?jiān)椒?，?葛根總黃酮提取工藝比較[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（4）：929-931.

Studies on extraction of total flavonoids of compound Sanghuang granules

CHEN Yuwei ZHANG Hongyu SONG Qifen XU Maoyi HUANG Yueyan
Medical College of Jiaxing Universtity,Jiaxing 314001,China

Objective To optimize the extraction process for compound sanghuang granules.Methods Factors affecting the ethanol extraction process to flavonoids of compound sanghuang granules was studied,the best preparation technological conditions was screened by orthogonal design.Results The optimal extraction technique conditions were as follows:20 times of amount of 70% alcohol,extracted for 3 times,each time for 2 hours.High yield of extractum (30.29%) and high content of flavonids (10.39%) are obtained with the present technology.Conclusion The extracting method are stables and replicable,which can provide reference for preparation of compound sanghuang granules.

Mulberry;Flavonoids;Extraction technology;Orthogonal test

R284.2

A

2095-0616（2012）03-152-02

浙江省嘉興市科技局資助項(xiàng)目（2010AY1066）；2010年度浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2010R417005）。

▲通訊作者

2011-12-23）