純化紅茶多糖抑制白血病細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

彭利劍，趙曉盼，王海杰，趙文秀 (.德惠市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 德惠 30300;.吉林醫(yī)藥學(xué)院008級(jí)藥學(xué)本科，吉林吉林 303;3.吉林醫(yī)藥學(xué)院化學(xué)教研室，吉林吉林 303)

中國(guó)是茶文化的發(fā)源地，傳統(tǒng)中醫(yī)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)都重視茶的藥用研究［1］。糖多糖除具有降血脂、防治血栓和增強(qiáng)免疫等功效外，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)粗制多糖對(duì)多種腫瘤有抑制作用［2］。我國(guó)的產(chǎn)茶區(qū)分布廣，茶葉品種多，但對(duì)茶的成分和功效影響最大的卻是茶葉發(fā)酵的程度。綠茶為非發(fā)酵茶，紅茶為充分發(fā)酵茶，而烏龍茶屬于半發(fā)酵茶。茶的鮮葉經(jīng)發(fā)酵后所含的多酚被氧化、葉綠素被分解，因此變?yōu)榧t色、褐色或黑色;此過(guò)程中糖的含量和結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變［3］。目前認(rèn)為，紅茶的糖類(lèi)含量相對(duì)高，組成與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從中提取多糖抗腫瘤的研究受到重視。本研究以中國(guó)福建的“正山小種”紅茶為原料，采用水浸泡的方式提取茶多糖，用大孔樹(shù)脂層析法制備純化的紅茶多糖(black tea polysaccharides，bTPS)，并采用酪胺還原法標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fluorescinisothiocyate，F(xiàn)ITC)，以bTPS和FITC-bTPS為材料，研究純化紅茶多糖對(duì)白血病細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人白血病細(xì)胞K562和U937凍存于液氮中;自制bTPS和FITC-bTPS避光保存于-20℃;1640培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司;小牛血清購(gòu)自浙江黃巖四季青公司;CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇K562細(xì)胞和U937細(xì)胞，在含10%血清的1640培養(yǎng)液、37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，每周傳代3次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

將細(xì)胞濃度調(diào)整為104/mL，按每孔100 μL接種96孔板，用1640培養(yǎng)稀釋 bTPS，分別加入到96孔板，使終濃度分別為 0、25、50、75 和 100 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，空白對(duì)照組加入10 μL的PBS。37℃孵育2 h后，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm的吸光度值(A450)。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)

1.4 輻射條件及測(cè)量工具

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)密度為5×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，加FITC-bTPS使其終濃度分別為0、25、50 和 100 μg/mL，室溫下避光反應(yīng) 1 h 后 PBS洗2次，將細(xì)胞懸于250 μL PBS，加入等體積的4%多聚甲醛，細(xì)胞被固定于2%的多聚甲醛。相同方法加入50 μg/mL的FITC-bTPS，與細(xì)胞共同孵育時(shí)間分別0、30、60和120 min，洗滌后固定細(xì)胞。細(xì)胞樣品避光存放于4℃冰箱，24 h內(nèi)完成流式細(xì)胞術(shù)分析。先以無(wú)FITC-bTPS處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，收集細(xì)胞在FL1(525 nm)通道內(nèi)的熒光信號(hào);調(diào)節(jié)電壓和增益，使細(xì)胞群位于陰性區(qū)域內(nèi)，設(shè)置陰性門(mén)“N”和陽(yáng)性門(mén)“P”。來(lái)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞的百分率和陽(yáng)性細(xì)胞群平均熒光強(qiáng)度(mean)來(lái)顯示FITC-bTPS與細(xì)胞間的結(jié)合。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值代表最終結(jié)果，均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 bTPS抑制白血病細(xì)胞增殖

隨濃度增加(0、25、50、75 和 100 μg/mL)，U937和K562細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，相同濃度下bTPS對(duì)U937細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于K562細(xì)胞 (P＜0.05)(圖1)。

圖1 bTPS抑制U937和K562細(xì)胞增殖

2.2 FITC-bTPS與白血病細(xì)胞結(jié)合

50 μg/mL的 FITC-bTPS 反應(yīng)1 h，U937 和 K562細(xì)胞中陽(yáng)性百分率接近;但前者熒光強(qiáng)度值高(P＜0.05)(圖2)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，U937細(xì)胞陽(yáng)性率隨FITC-bTPS濃度增加而增加(表1);但反應(yīng)時(shí)間對(duì)陽(yáng)性率影響較小(表2)。

圖2 FITC-bTPS與U937和K562細(xì)胞結(jié)合

表1 濃度對(duì)FITC-bTPS結(jié)合白血病細(xì)胞的影響(S)

表1 濃度對(duì)FITC-bTPS結(jié)合白血病細(xì)胞的影響(S)

*對(duì)照組比較，P＜0.05

組 別g/mL 21.3±3.4 18.4±3.7 50 μg/mL 44.8 ±4.5* 43.2 ±5.1*100 μg/mL 67.5 ±6.3* 64.2 ±5.2 U937 K562 25 μ*

表2 孵育時(shí)間對(duì)FITC-bTPS結(jié)合白血病細(xì)胞的影響(S)

表2 孵育時(shí)間對(duì)FITC-bTPS結(jié)合白血病細(xì)胞的影響(S)

*對(duì)照組比較，P＜0.05

組 別U937 K562 30 min 41.3±4.2 39.5±3.9 60 min 44.8±4.5 51.6±5.7*120 min 43.2±5.1 47.5±4.8*

3 討論

多糖(polysaccharides)是由單糖之間脫水而形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線(xiàn)性或分枝連接而成的聚合物。多糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁中，參與細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)［3］。人們對(duì)動(dòng)物來(lái)源的殼聚糖，植物來(lái)源的靈芝多糖和細(xì)菌來(lái)源的脂多糖、甘露糖等多糖的研究較多，上述多糖均具有一定的免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤活性。甘露聚糖與細(xì)胞膜上甘露糖受體結(jié)合，而殼聚糖和脂多糖與Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)中的 TLR-2、TLR-4和TLR-7結(jié)合［4］。單核巨噬細(xì)胞TLR-4等結(jié)合配體后，細(xì)胞內(nèi)的p-38 MAPK信號(hào)通路被激活，啟動(dòng)IL-2、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 等細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞吞噬、殺傷功能;而活化巨噬細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞因子等方式促進(jìn)T細(xì)胞的活化。雖然大量實(shí)驗(yàn)表明多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能抗腫瘤，但近年來(lái)多糖分子抑制腫瘤細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)其凋亡的證據(jù)也陸續(xù)被報(bào)道。例如，靈芝多糖直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的白血病細(xì)胞THP-1和HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡;殼聚糖抑制乳腺癌細(xì)胞 MCF-7增殖并誘導(dǎo)其凋亡［5-6］。以往對(duì)茶葉抗腫瘤成分的研究主要集中于多酚化合物，因此茶多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用了解較少。本研究發(fā)現(xiàn)，純化的bTPS可以濃度依賴(lài)的方式直接抑制兩種白血病細(xì)胞的增殖。FITC-bTPS結(jié)合細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)分析其以濃度依賴(lài)的方式與細(xì)胞結(jié)合。相同濃度的FITC-bTPS處理后，U937細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度高于K562細(xì)胞，而bTPS對(duì)U937的抑制效應(yīng)也強(qiáng)于K562細(xì)胞。這些結(jié)果表明，bTPS可直接結(jié)合腫瘤細(xì)胞而抑制其增殖。

利用純化的bTPS和FITC-bTPS，不僅可以測(cè)定茶多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響，也可利用熒光素的示蹤作用，深入探討其抗腫瘤的機(jī)制。bTPS是否也與細(xì)胞表面的TLRs結(jié)合而發(fā)揮作用，將在今后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探討。

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