分枝桿菌噬菌體D29與巨噬細(xì)胞的相互作用及其機(jī)制

張紅梅，梁 梅，劉 平，烏亭亭，郭述良

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400016)

目前結(jié)核疫情和耐藥形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻，已有40多年沒(méi)有突破性的抗結(jié)核藥物問(wèn)世，急需開(kāi)發(fā)治療結(jié)核病的新藥物、新技術(shù)和新方法。由于噬菌體能夠特異性裂解宿主菌，金黃色葡萄球菌噬菌體、銅綠假單胞菌噬菌體等多種噬菌體已用于臨床試驗(yàn)。面對(duì)日趨嚴(yán)峻的結(jié)核疫情，分枝桿菌噬菌體D29因能特異性裂解結(jié)核菌而成為研究熱點(diǎn)，國(guó)家“十一五”重大專項(xiàng)課題已經(jīng)給予支持，該課題前期研究顯示：分枝桿菌噬菌體D29不僅能裂解巨噬細(xì)胞外的結(jié)核菌，且能裂解巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌。但D29是如何進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入巨噬細(xì)胞后又是如何進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌內(nèi)以及D29在巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌內(nèi)外分布的滴度變化是本文作者關(guān)注的問(wèn)題，目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)探討分枝桿菌噬菌體D29是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞的免疫功能及D29被巨噬細(xì)胞吞噬后在結(jié)核菌內(nèi)外的滴度變化，旨在為研究D29用于治療結(jié)核病的機(jī)制及臨床治療劑量的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、動(dòng)物、主要儀器和試劑

分枝桿菌噬菌體D29及恥垢分枝桿菌由本室培養(yǎng)，H37RV結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株來(lái)自重慶市肺科醫(yī)院。恥垢分枝桿菌、H37RV結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)株分別在改良羅氏培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)3～7 d和2～4周，分枝桿菌噬菌體D29的擴(kuò)增和效價(jià)檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1-2]，純化方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]，4℃保存。7～8周齡SPF級(jí)BALB/C小鼠，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。5%CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；6孔、12孔培養(yǎng)板；平皿(Greiner公司)；倒置顯微鏡(OLYMPUS)；低速水平離心機(jī)(長(zhǎng)沙平凡儀器儀表公司)；超速低溫離心機(jī)(Sigma 公司)；PCR儀(TaKaRa Code.TP800)；酶標(biāo)儀；恒溫水浴箱(金壇市金偉實(shí)驗(yàn)儀器)；引物：5′-AGCTGGCCGGTACGACTCAG-3′，5′-GAGTCAACACCACGGCGGT-3′(TaKaRa)。胎牛血清(FBS，Hyclone公司)；RPMI 1640(Hyclone公司)；硫酸亞鐵銨(FAS，Sigma公司)； 7H9培養(yǎng)基、7H10培養(yǎng)基(BD公司)；牛血清復(fù)合物(OADC，BD公司)；IL-12 ELISA試劑盒(達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；NO ELISA試劑盒(R&B公司)。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、DL 2 000 DNA Marker、pMD 18-T Vector、細(xì)菌基因組提取試劑盒、病毒RNA/DNA提取試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 腹腔巨噬細(xì)胞的提取和純化[4]

1.2.1 巨噬細(xì)胞的提取 小鼠腹腔注射巰乙酸酯肉湯1 mL，72 h后采用頸椎脫臼法處死。75%酒精浸泡7 min后，腹腔注射PBS 4 mL/只，輕揉腹部2 min后，在無(wú)菌條件下用解剖剪和解剖鑷逐層打開(kāi)腹腔，回收透明的腹腔液。腹腔液1 000 r· min-1離心7 min，重懸后再用RPMI 1640液洗滌2次，最后加入RPMI 1640(10%FBS)制成細(xì)胞懸液。采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù) 在細(xì)胞板上采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。公式為：細(xì)胞計(jì)數(shù)(mL-1)=(4個(gè)大格子細(xì)胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)。根據(jù)細(xì)胞懸液的濃度用RPMI 1640(10%FBS)調(diào)整至5×105mL-1，作為工作濃度。

1.2.3 巨噬細(xì)胞的純化 將工作濃度的細(xì)胞懸液加入6孔細(xì)胞板中，每孔l mL，37℃、5%CO2飽和濕度條件下孵育3 h，使巨噬細(xì)胞貼壁，棄去未貼壁細(xì)胞，即得到純化的巨噬細(xì)胞。

1.3 巨噬細(xì)胞的吞噬作用

1.3.1 巨噬細(xì)胞對(duì)分枝桿菌噬菌體D29的吞噬 純化的巨噬細(xì)胞(5×105個(gè)/孔)中每孔加入100 μL分枝桿菌噬菌體D29(1×108PFU)，分別于5、10、15、20和25 min時(shí)加入8%FAS 100 μL，作用5 min以殺滅未進(jìn)入巨噬細(xì)胞的D29，棄去上清，PBS沖洗3次，最后加入phage buffer 1 mL，采用反復(fù)凍融[5]的方法使巨噬細(xì)胞裂解，收集孔內(nèi)所有裂解液，10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液于離心管中，采用小平皿法鋪板測(cè)定所有離心管中D29效價(jià)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，孔內(nèi)不加巨噬細(xì)胞，以證明8%FAS作用5 min是否能將巨噬細(xì)胞外D29全部殺滅。另設(shè)D29組，效價(jià)1.4×107PFU·mL-1，用phage buffer 10×梯度稀釋至1.4×102PFU·mL-1，每個(gè)稀釋度的D29液經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融后，小平皿法測(cè)定效價(jià)，以證明經(jīng)反復(fù)凍融后D29效價(jià)下降程度。

1.3.2 巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37RV)的吞噬 ①H37RV單細(xì)胞懸液的制備：將在改良L-J培養(yǎng)基上37℃生長(zhǎng)3～4周的結(jié)核分枝桿菌菌落用7H9液體培養(yǎng)基洗下后研磨，用8 μm濾器過(guò)濾，麥?zhǔn)媳葷岱y(cè)定菌液濃度，調(diào)整濃度至1 g·L-1，即得到H37RV單細(xì)胞懸液，作為巨噬細(xì)胞吞噬H37RV的工作濃度。②巨噬細(xì)胞對(duì)H37RV的吞噬：純化的巨噬細(xì)胞(5×105個(gè)/孔)中每孔加H37RV單細(xì)胞懸液1 mL，37℃、5%CO2孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加37℃的PBS(pH 7.0)2 mL，采用不離心方法洗滌3次，以去除游離的巨噬細(xì)胞和未被吞噬的H37RV。同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔以證實(shí)洗滌3次是否能將未被吞噬的菌落洗脫。

1.4 分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細(xì)胞內(nèi)的變化

分別將1×108PFU和1×107PFU的D29加入到純化的巨噬細(xì)胞內(nèi)(5×105個(gè)/孔)，于20 min后用FAS殺滅細(xì)胞外的D29，分別于0、10、20和30 min反復(fù)凍融裂解巨噬細(xì)胞，收集所有液體于離心管，10 000 r· min-1離心10 min，平皿法鋪板測(cè)定效價(jià)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 分枝桿菌噬菌體D29對(duì)巨噬細(xì)胞的影響

純化的巨噬細(xì)胞分為3組(一塊24孔板，每6孔為一組)，分別為：①巨噬細(xì)胞空白對(duì)照組；②巨噬細(xì)胞+LPS組，加入LPS使其終濃度為10 mg·L-1，為陽(yáng)性對(duì)照；③巨噬細(xì)胞+D29組，將1×108PFU的D29加入巨噬細(xì)胞孔內(nèi)，于20 min時(shí)FAS殺滅PBS緩沖液沖洗后，加入RPMI 1640培養(yǎng)基2 mL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12 h后分別吸取3組中每孔的培養(yǎng)上清液，每組均獲取6個(gè)樣品，ELISA法分別檢測(cè)IL-12與NO含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及細(xì)胞上清液IL-12與NO的檢測(cè)嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6 分枝桿菌噬菌體D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌的時(shí)間

工作濃度的H37RV單細(xì)胞懸液1 mL/孔加入純化的巨噬細(xì)胞中，37℃、5%CO2孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加37℃的 PBS 2 mL洗滌3次，D29(1×109PFU·mL-1)100 μL/孔加入巨噬細(xì)胞，20 min后殺滅未進(jìn)入巨噬細(xì)胞的D29，分別于0、10、20、30、40和200 min裂解巨噬細(xì)胞[6]，待巨噬細(xì)胞完全裂解后，加入8%FAS殺滅未進(jìn)入結(jié)核菌的D29，10 000 r·min-1離心10 min，用沉淀鋪板，觀察噬菌斑出現(xiàn)時(shí)間。同時(shí)設(shè)2孔對(duì)照，巨噬細(xì)胞中不加結(jié)核菌，以證明FAS能否殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)所有D29。

1.7 分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌內(nèi)外的滴度變化

1.7.1 結(jié)核菌外的滴度變化 工作濃度的H37RV單細(xì)胞懸液1 mL/孔加入純化的巨噬細(xì)胞中，37℃、5%CO2孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加37℃的PBS 2 mL洗滌3次，1×109、1×108PFU D29分別加入巨噬細(xì)胞中，分別于30、40、50、60、190、210 min和48 h后棄上清，裂解巨噬細(xì)胞，10 000 r·min-1離心，收集上清液提取DNA(按照說(shuō)明書(shū)操作)，行熒光定量PCR檢測(cè)。①構(gòu)建DNA標(biāo)準(zhǔn)品：將片段序列為430 bp的目的基因片段克隆到pMD18-T Vector上，經(jīng)純化、線性化質(zhì)粒，經(jīng)抽提得標(biāo)準(zhǔn)品。②引物序列：5′-AGCTGGCCGGTACGACTCAG-3′，5′-GAGTCAACA-CCACGGCGGT-3′。③標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將DNA標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102及10 copies· μL-1)作為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，反應(yīng)組成為SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，Primer F/R mix 1 μL，Template 1 μL，dH2O 9.5 μL；反應(yīng)條件為95℃、30 s，95℃、5 s,60℃、30 s，后兩步進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。④樣品檢測(cè)：每個(gè)樣品復(fù)測(cè)1次，反應(yīng)組成及條件均按步驟③操作。

1.7.2 結(jié)核菌內(nèi)的滴度變化 將1.7.1中10 000 r·min-1離心后的沉淀提取DNA(按照細(xì)菌基因組提取試劑盒)，做熒光定量PCR檢測(cè)，步驟如1.7.1中所述。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 巨噬細(xì)胞對(duì)分枝桿菌噬菌體D29的吞噬情況

各個(gè)效價(jià)的D29液在反復(fù)凍融前后平皿法測(cè)得效價(jià)見(jiàn)表1。巨噬細(xì)胞在加入D29不同時(shí)間，裂解細(xì)胞后平皿法所得D29滴度見(jiàn)表2。無(wú)巨噬細(xì)胞的對(duì)照孔在加入8%FAS作用5 min后無(wú)噬菌斑出現(xiàn)，說(shuō)明8%FAS 100 μL作用5 min可使巨噬細(xì)胞外的所有D29失活。表1顯示：不同效價(jià)D29經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融后，滴度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；表2顯示：隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，巨噬細(xì)胞吞噬的D29量(鋪板法)隨之增加，在作用20 min時(shí)吞噬量多，與25 min時(shí)相比雖有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此在觀察D29與巨噬細(xì)胞相互作用時(shí)感染時(shí)間選擇20 min為宜。

表1 不同效價(jià)D29液在反復(fù)凍融前后效價(jià)比較

表2 與巨噬細(xì)胞作用不同時(shí)間后D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞的數(shù)量

2.2 分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細(xì)胞內(nèi)的滴度變化

1×108及1×107PFU D29與巨噬細(xì)胞共同孵育20 min后，經(jīng)反復(fù)凍融法(約160 min)后鋪板測(cè)D29效價(jià)，均有約104PFU的D29被巨噬細(xì)胞吞噬，進(jìn)入巨噬細(xì)胞約170 min后D29存活量即開(kāi)始減少，180 min后大量失活，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，190 min時(shí)巨噬細(xì)胞內(nèi)已無(wú)存活的D29。見(jiàn)表3。

2.3 分枝桿菌噬菌體D29對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響

D29被巨噬細(xì)胞吞噬后，上清液中IL-12和NO水平與巨噬細(xì)胞空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但明顯少于LPS陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后存活量比較

表4 巨噬細(xì)胞上清液IL-12和NO水平

2.4 分枝桿菌噬菌體D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌內(nèi)的時(shí)間

結(jié)核菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，1×109PFU·mL-1D29以100 μL/孔加入巨噬細(xì)胞，孵育20 min后殺滅未進(jìn)入巨噬細(xì)胞的D29，即刻裂解巨噬細(xì)胞并加入8%FAS后，離心用沉淀鋪板未見(jiàn)噬菌斑，10 min時(shí)裂解巨噬細(xì)胞可見(jiàn)17個(gè)噬菌斑，20 min時(shí)可見(jiàn)20個(gè)噬菌斑，30 min時(shí)可見(jiàn)25個(gè)噬菌斑，40 min時(shí)可見(jiàn)75個(gè)噬菌斑，200 min時(shí)可見(jiàn)60個(gè)噬菌斑(圖1)。未加結(jié)核菌的對(duì)照組于10 min裂解巨噬細(xì)胞后無(wú)噬菌斑出現(xiàn)，說(shuō)明FAS能殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)所有D29。

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)分枝桿菌噬菌體D29在巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌內(nèi)外的滴度變化

加入1×109及1×108PFU D29于巨噬細(xì)胞中，作用40、50 min時(shí)，D29在結(jié)核菌內(nèi)外滴度均有一過(guò)性升高，此后結(jié)核菌內(nèi)外滴度均下降，作用190、210 min時(shí)D29量大幅度減少，48 h時(shí)結(jié)核菌內(nèi)外幾乎不能檢測(cè)到D29(圖中未給予表示)。見(jiàn)圖2和3。

3 討 論

隨著耐藥結(jié)核的出現(xiàn)，噬菌體療法顯得尤為重要，但結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞后是否會(huì)被巨噬細(xì)胞殺滅、是否會(huì)影響巨噬細(xì)胞的免疫功能、進(jìn)入巨噬細(xì)胞后在結(jié)核菌內(nèi)外的滴度變化對(duì)于確定D29用于治療結(jié)核病的給藥劑量尤為重要。D29被巨噬細(xì)胞吞噬后很快失活，但當(dāng)巨噬細(xì)胞內(nèi)存在結(jié)核菌時(shí)，D29存活時(shí)間延長(zhǎng)，提示當(dāng)D29用于治療時(shí)可選擇無(wú)致病性的恥垢分枝桿菌或母牛分枝桿菌作為載體，可能會(huì)延長(zhǎng)D29在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活時(shí)間，從而更好地發(fā)揮裂解胞內(nèi)結(jié)核菌的作用。有研究[7]表明：將大腸桿菌和T4噬菌體預(yù)先共培養(yǎng)15 min后再與中性粒細(xì)胞混合，可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞吞噬大腸桿菌的能力。這說(shuō)明本文作者選用恥垢分枝桿菌或是母牛分枝桿菌作為載體，可能會(huì)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)其載體的吞噬能力，從而會(huì)有更多的D29到達(dá)靶細(xì)胞發(fā)揮裂解作用，這對(duì)治療胞內(nèi)結(jié)核菌的感染有很大益處。

圖1 D29在不同時(shí)間進(jìn)入巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌內(nèi)的數(shù)量

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 D29被巨噬細(xì)胞吞噬后分布于結(jié)核菌內(nèi)外的滴度變化

結(jié)核病發(fā)病時(shí)表現(xiàn)為T(mén)h1免疫應(yīng)答受抑制和(或)Th2應(yīng)答亢進(jìn)，IL-12是一種異源二聚體的細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞，并促進(jìn)Th1增殖，有可能調(diào)節(jié)機(jī)體的抗結(jié)核免疫。NO是一種多功能的信息分子，可在巨噬細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及胞內(nèi)殺菌作用等。本研究結(jié)果顯示：D29被巨噬細(xì)胞吞噬后，細(xì)胞上清液中IL-12及NO水平與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明D29不會(huì)影響巨噬細(xì)胞的免疫功能。而Eriksson等[8]研究顯示：噬菌體可增加小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12水平。這可能與本研究所用噬菌體株不同及脾組織中含有較多淋巴細(xì)胞有關(guān)。

Rosanna等[9]證實(shí)：phage MSa能夠減少甚至殺滅小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的金黃色葡萄球菌；彭麗等[4]也證實(shí)：D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞后可以減少巨噬細(xì)胞內(nèi)的活菌數(shù)量。本研究證實(shí)了D29進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，能吸附并感染結(jié)核菌，通過(guò)在其中復(fù)制、增殖殺滅結(jié)核菌，但D29感染效率不高，這可能與胞內(nèi)弱酸環(huán)境影響D29的吸附有關(guān)[10]。在本研究中，D29與吞噬了結(jié)核菌的巨噬細(xì)胞孵育40和50 min時(shí)，D29在結(jié)核菌內(nèi)外滴度均有一過(guò)性升高，這可能有兩方面原因：①隨著時(shí)間延長(zhǎng)，進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的D29增多，進(jìn)入結(jié)核菌的D29量也增多；②隨著D29進(jìn)入結(jié)核菌，其DNA在其中開(kāi)始復(fù)制、增殖，這可以用David等[11]的研究結(jié)果解釋：DNA在結(jié)核菌內(nèi)復(fù)制開(kāi)始于感染后20 min，10 min后復(fù)制1代。但是此后結(jié)核菌內(nèi)外滴度均下降，孵育190、210 min時(shí)D29量大幅度減少，48 h時(shí)結(jié)核菌內(nèi)外幾乎不能檢測(cè)到D29，分析原因可能是由于巨噬細(xì)胞對(duì)其殺傷作用大，D29從結(jié)核菌內(nèi)釋放出來(lái)后未能感染其他結(jié)核菌就被溶酶體消化了，提示在用D29治療結(jié)核病時(shí)可能需要多次給藥。但也有可能是因?yàn)榻Y(jié)核菌長(zhǎng)期處在D29的環(huán)境里發(fā)生了變異，使其對(duì)D29產(chǎn)生抗性，因而D29不能吸附并進(jìn)入結(jié)核菌而長(zhǎng)期暴露在巨噬細(xì)胞中被消化，具體原因還有待下一步證實(shí)。

本研究中擴(kuò)增D29最大滴度為1×109PFU·mL-1，所以在使用劑量上受到了很大限制，根據(jù)本研究結(jié)果，D29滴度越高，進(jìn)入巨噬細(xì)胞中及巨噬細(xì)胞中結(jié)核菌內(nèi)的數(shù)量越多，且D29不會(huì)影響巨噬細(xì)胞的免疫功能，如果D29用于治療結(jié)核病，臨床上可考慮使用較大劑量。

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