擬南芥中熱脅迫相關(guān)microRNA的差異表達(dá)

馮靜弦，汪啟明，胡 琪，饒力群

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

在高級(jí)真核生物的基因組中，大部分的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼RNA，僅不到3%的基因編碼蛋白質(zhì)[1]。microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于植物、動(dòng)物、藻類，以及其他一些單細(xì)胞生物和DNA病毒中的非編碼小分子RNA，在進(jìn)化上具有高度保守性并且能在翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA是由細(xì)胞核內(nèi)的pri-miRNA經(jīng)Drosha RNase將其切割成具有回文結(jié)構(gòu)的RNA前體（pre-miRNA），再經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成一種大小約21～23個(gè)堿基小分子成熟的miRNA[2-3]。在植物中，miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同來(lái)指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯[4-5]。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調(diào)節(jié)途徑，包括激素調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及逆境環(huán)境的適應(yīng)能力等[6-8]。大量研究結(jié)果表明，在植物中，干旱、鹽堿、冷害、高溫等非生物脅迫，能夠影響基因在植物內(nèi)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)調(diào)控[9]。高溫是一種限制植物生長(zhǎng)和分布的重要自然災(zāi)害之一[10]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為一種調(diào)控因子參與到植物響應(yīng)外界脅迫的過(guò)程中。當(dāng)miRNA響應(yīng)高溫脅迫的調(diào)控時(shí)，其表達(dá)量會(huì)升高，進(jìn)而下調(diào)其靶基因，這些靶基因可能是逆境脅迫的負(fù)調(diào)控子，從而達(dá)到幫助植物度過(guò)逆境的作用。2004年Sunkar等構(gòu)件了經(jīng)高鹽、干旱、冷和ABA處理的擬南芥小RNA庫(kù)，發(fā)現(xiàn)26個(gè)新miRNA以及一些miRNA能受到非生物逆境脅迫的誘導(dǎo)。對(duì)于不同的植物、不同的植物組織和器官，應(yīng)當(dāng)選擇不同的提取方法，因此，筆者以擬南芥葉片為材料選擇了3種常用的提取方法并加以改進(jìn)，比較其提取效果。只有提取到質(zhì)量高完整性好的總RNA，才能確保半定量RT-PCR準(zhǔn)確檢測(cè)到熱脅迫相關(guān)基因表達(dá)量，從而真實(shí)反映起始模板中基因表達(dá)量的差異[11]。本研究在生物信息學(xué)的基礎(chǔ)上通過(guò)半定量RT-PCR技術(shù)篩選到4個(gè)與熱脅迫相關(guān)的miRNA。半定量RT-PCR技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的探討基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段[12]。此方法的原理是在PCR體系中加入內(nèi)對(duì)照系統(tǒng)，將樣本間的模板質(zhì)量和擴(kuò)展效率調(diào)整到同一水平，即利用相同量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以及PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的表達(dá)量的差異，可為進(jìn)一步研究擬南芥熱脅迫相關(guān)miRNAs的表達(dá)機(jī)制及其響應(yīng)熱脅迫誘導(dǎo)的作用過(guò)程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的Col-4野生型擬南芥，將擬南芥置于38℃的光照培養(yǎng)箱中分別處理 0、0.5、1、2、4 h 后，取其葉片，-80℃保存。

1.1.2 儀 器 Eppendorf高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、紫外分光光度計(jì)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像分析儀、電子天平（1/1 000 g）

1.1.3 試 劑 焦碳酸二乙酯（DEPC）One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit與PMD18-T載體試劑盒均為Takara產(chǎn)品；Trizol試劑為invitrogen產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶為賽博產(chǎn)品；提取液1：2%CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），1.5 mol/L NaCl，0.20 mmol/L EDTA（pH=8.0），1%β-mercaptoethanol，5%PVP；提取液 2：50 mmol/L of Tris-HCl（pH=9.0），100 mmol/L NaCl，1%SDS，5%PVP；Li－Cl；氯仿/異丙醇（24∶1）；氯仿；異丙醇；水飽和酚；無(wú)水乙醇。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 引物采用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)，由華大基因公司合成，miRNA引物及相關(guān)引物序列如表1所示。

表1 miRNA引物及相關(guān)引物序列

1.2.2 擬南芥總RNA的提取 分別稱取0.1 g新鮮擬南芥葉片，放入液氮預(yù)冷過(guò)的研缽中，迅速將材料研磨成粉末（研磨的過(guò)程中要不斷補(bǔ)充液氮），轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)冷的1.5 mL離心管中。

（1）改良CTAB法：向離心管中加入0.5 mL提取液 1，劇烈振蕩混勻，65℃溫浴 20 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等體積的氯仿/異丙醇（24∶1）振蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液加入1/2體積氯仿振蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入1/4體積8 mol/L的LiCl，-80℃沉淀過(guò)夜，4℃、12 000 r/min 離心 20 min；棄上清液，加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心 5 min；超凈工作臺(tái)上風(fēng)干乙醇，用30 μLDEPC水溶解。

（2）改良的熱酚法：向離心管中加入0.4 mL預(yù)熱的水飽和酚，0.6 mL RNA 提取液 2，0.05 mL β-巰基乙醇，振蕩混勻后，冰浴10 min；加入0.4 mL氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積的氯仿/異丙醇（24∶1），混勻后冰浴 10 min，4℃、12 000 r/min離心 10 min，加入 1/4體積 8 mol/L LiCl，-20℃沉淀3 h，加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min；超凈工作臺(tái)上風(fēng)干乙醇，用30 μL DEPC水溶解。

（3）Trizol提取法：向離心管中加入1 mL Trizol，劇烈振蕩混勻，在冰上靜置15 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置15 min，4℃、12 000 r/min 離心 15 min；取上清液約 400 μL到新的離心管中，加入400 μL異丙醇，輕輕混勻，-20℃沉淀 0.5 h，4℃、12 000 r/min離心 10 min；加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min；超凈工作臺(tái)上風(fēng)干乙醇，用30 μL DEPC水溶解。分別取4 μL上樣，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，用紫外分光儀檢測(cè)OD260/OD280值，如果結(jié)果在1.9～2.0時(shí)，說(shuō)明提取的總RNA質(zhì)量較好，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2.3 半定量RT-PCR 采用Takara公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒給miRNA加A尾后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)引物一條由試劑盒提供的通用引物（Uni-miR qPCR Primer），一條自行設(shè)計(jì)的特異性引物，完成半定量RT-PCR反應(yīng)（以β-actin作為內(nèi)參基因）。RT反應(yīng)體積為 20 μL，先加入 1 μL 總 RNA，再加入 10 μL 2 ×miRNA Reaction Buffer Mix，2 μL 0.1%BSA，2 μL miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix，用 DEPC水補(bǔ)足至 20 μL，混勻后 37℃反應(yīng) 60 min，85℃ 5 s終止反應(yīng)。

反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取1 μL cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體積為 25 μL，1 μL 模板，1 μL dNTP，2.5 μL Buffer，0.5 μLUni-miR qPCR Primer，0.5 μL 特異性引物，0.5 μL Taq 酶，用水補(bǔ)足至 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，miR414、miR415、miR837-5p 25 個(gè)循環(huán)，miRf10564-akr 28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

用含EB（0.5 μg/mL）的2%的瓊脂糖凝膠在電壓100 V下電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物。在凝膠成像儀下觀察miRNA在不同時(shí)間熱處理下的表達(dá)情況。1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 利用苯酚氯仿抽提的方法回收DNA片段。與PMD-18T載體連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)藍(lán)白斑篩選鑒定PCR陽(yáng)性克隆，測(cè)序工作委托華大基因公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

OD260/OD280的比值可以確定樣品的純度，提取樣品OD260/OD280的比值越接近2.0，說(shuō)明RNA的純度較高，樣品提取得好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；當(dāng)比值低于1.7，所得RNA不可用，需重新提取。改良CTAB法、Trizol法、改良熱酚法的OD260/OD280比值分別為 1.56、1.93、1.96，RNA 平均產(chǎn)量分別為480、1 980、300 μg/mL。Trizol法和改良熱酚法的OD260/OD280比值均在1.9到2.0之間，但是改良的熱酚法所得總RNA的產(chǎn)量過(guò)低。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果顯示，28 S和18 S的條帶都比較清晰，并且28 S的條帶亮度約為18 S亮度的兩倍（圖1），改良的CTAB法沒(méi)有提取到高質(zhì)量的RNA，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示有明顯的拖帶，所以Trizol法是最適合的提取方法。

圖1 總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果

2.2 半定量RT-PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)差異

在總RNA逆轉(zhuǎn)錄時(shí)同時(shí)進(jìn)行加poly-A法，可以在一次逆轉(zhuǎn)錄后獲得所有的miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。其原理是在成熟的miRNA的3′端加上一個(gè)poly-A尾巴，這樣Oligo-dT（逆轉(zhuǎn)錄引物）就很容易結(jié)合到mRNA上來(lái)合成cDNA，一次逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。PCR反應(yīng)過(guò)程中，5′端的反向引物為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供的 Universal Adapter Primer，3′端的為自行設(shè)計(jì)的miRNA Specific Forward Primer。

以擬南芥中成熟葉片經(jīng)過(guò)不同時(shí)間熱處理后的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄后采用β-actin作為內(nèi)參基因，采用表1中的引物對(duì)擬南芥中miR414、miR415、miR837-5p和miR10546-akr進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)，通過(guò)比較條帶亮度的差異來(lái)分析4種miRNA在38℃不同時(shí)間的熱處理下的表達(dá)差異。從電泳條帶的亮度上可以看出（圖2），擬南芥中 miR414、miR415、miR837-5p 和 miRf10546-akr這 4 個(gè)基因在 38℃分別熱處理0、0.5、1、2、4 h 后的表達(dá)差異。

圖2 熱脅迫處理不同時(shí)間下擬南芥中miRNA的表達(dá)情況

隨著 38℃處理時(shí)間的延長(zhǎng)，miR414、miR415、miR837-5p和miRmiRf10546-akr的表達(dá)量總體均呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)。miR414在0.5 h處理后就出現(xiàn)了明顯的表達(dá)量增加的情況，miR414的每個(gè)處理時(shí)間的表達(dá)量都明顯高于miR415、miR837-5p和miRmiRf10546-akr；miR837-5p 在處理 0.5、1 h 時(shí)沒(méi)有很明顯變化，但在處理2 h后其表達(dá)量出現(xiàn)顯著的提高；miR415和miRmiRf10546-akrr在處理0.5、1、2 h后都沒(méi)有很明顯的表達(dá)量的提高，但在4 h后出現(xiàn)表達(dá)量的明顯提高。miR414、miR415、miR837-5p和miRmiRf10546-akrr在 38℃熱處理不同時(shí)間后其表達(dá)量都有提高，未處理的對(duì)照和熱脅迫處理不同時(shí)間下的表達(dá)差異，可能說(shuō)明它們的表達(dá)與植物抗熱機(jī)制存在一定的關(guān)系，即其相關(guān)靶基因在熱脅迫下有相對(duì)不同的調(diào)節(jié)。

3 討論

在動(dòng)植物表達(dá)分析中，常常用到的是實(shí)時(shí)定量PCR、Northern blot、基因芯片等半定量技術(shù)，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要特殊的儀器，而半定量RT—PCR技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)便，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于此類研究中[13-15]。近年來(lái)，國(guó)外的研究人員針對(duì)miRNA的長(zhǎng)度僅20～23個(gè)核苷酸，分別采用了連線性接頭或者設(shè)計(jì)莖環(huán)引物等方式在動(dòng)植物組織中檢測(cè)到miRNA的表達(dá)[16-18]。石艷麗等[19]用半定量RT－PCR法測(cè)定鏈球菌透明質(zhì)酸合酶mRNA的水平，這對(duì)于深入探討透明質(zhì)酸發(fā)酵有重要意義。筆者運(yùn)用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了擬南芥4個(gè)miRNA的表達(dá)受到熱脅迫的誘導(dǎo)情況，結(jié)果表明在38℃不同時(shí)間處理下各個(gè)miRNA的表達(dá)情況都有差異，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量均出現(xiàn)明顯提高。

綜上所述，半定量RT-PCR技術(shù)能夠檢測(cè)到基因顯著的水平表達(dá)變化，該方法在各個(gè)研究領(lǐng)域都有著非常廣泛的應(yīng)用，隨著該技術(shù)的日趨成熟和完善，它將成為研究者有力的研究手段。

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