大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

燕學波，杜運華，呂安林，邢玉潔，胡朝暉，胡新君，岳 峰

近幾年自體骨髓間充質干細胞（BMMSCs）移植技術發(fā)展迅速，逐漸成為治療心肌梗死后心衰的有效辦法之一。Frieden-stein于1966年首先證實BMMSCs是骨髓基質的重要組成成分，在一定條件下能向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞分化。骨髓是由造血干細胞和非造血干細胞組成，BMMSCs是骨髓的非造血干細胞，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，在體外可被誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞等。BMMSCs因取材容易，不涉及倫理問題和無免疫排斥反應，被廣泛應用于各種動物實驗和臨床研究。但是目前尚未篩選出BMMSCs特征性的表面標記分子，因此無法直接鑒定BMMSCs。目前研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs表達間質細胞、內皮細胞、肌肉細胞等的一些表面標志抗原，而不表達造血干細胞的表面標志抗原。因此可以通過檢測BMMSCs陽性和陰性表面標志抗原的方法間接鑒定BMMSCs。主要的分離純化方法有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細胞儀篩選和免疫磁珠篩選。但是4種主要分離純化方法各有利弊，為此筆者提出，通過密度梯度離心法和貼壁法聯(lián)合分離純化BMMSCs，聯(lián)合細胞形態(tài)學變化和檢測傳代4代的BMMSCs表面陽性標志抗原CD44和表面陰性標志抗原CD45來鑒定BMMSCs。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠，體質量（120±20） g，SPF 級，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供，實驗過程中對動物的處置符合倫理學標準。

1.2 主要試劑及儀器 L-DMEM培養(yǎng)液，胰蛋白酶，胎牛血清 （FBS），F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液 （1.077 g/ml），F(xiàn)ITC標記的抗大鼠 CD44，PE標記的抗大鼠CD45，超凈工作臺，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，光學倒置相差顯微鏡，高速室溫離心機，流式細胞儀。

1.3 方法

1.3.1 BMMSCs分離、培養(yǎng)及傳代 ①采用頸椎脫臼法處死大鼠，在超凈臺中用不完全培養(yǎng)液徹底沖洗大鼠骨髓腔，獲取骨髓懸液；用密度為1.077 g/ml的Ficoll淋巴細胞分離液離心分離出BMMSCs，加入適量L-DMEM完全培養(yǎng)液 （L-DMEM，10%FBS，300 mg/L L-Gln，100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素），充分混勻，重懸、計數(shù)，以1×106/ml的細胞密度接種于T25無菌塑料培養(yǎng)瓶，隨后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中飽和濕度培養(yǎng)，3 d后首次更換新鮮L-DMEM培養(yǎng)液，去除未貼壁的懸浮細胞，以后換液1次/3 d，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待原代細胞長滿培養(yǎng)瓶底85%左右時傳代；②待原代細胞接近85%融合時傳代，加入2.5 g/L的胰蛋白酶2～3 ml，將培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察，待細胞間隙增大，回縮變圓時，立即棄去胰蛋白酶，加入適量L-DMEM培養(yǎng)液終止消化，按1∶2的比例將細胞懸液接種于L-DMEM培養(yǎng)基中，第3天首次換液，以后換液1次/3 d，傳代細胞記為P1，再次傳代細胞記為P2，培養(yǎng)至第4代，進行形態(tài)學觀察及表面標記抗原鑒定。

1.3.2 BMMSCs的鑒定

1.3.2.1 BMMSCs形態(tài)學變化 倒置相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長情況并拍照記錄典型細胞形態(tài)。

1.3.2.2 流式細胞儀鑒定 取第4代BMMSCs細胞，用PBS清洗之后加入胰蛋白酶進行消化，制成細胞懸液。將細胞懸液移入離心管中，室溫下1500 r/min，離心 5 min。用 PBS 洗滌 2 次，棄上清，余 50 μl，配成濃度為1×106/ml的細胞懸液。分別加入FITC標記的抗大鼠CD44單抗抗體2.5 μl，PE標記的抗大鼠 CD45 單抗抗體 5 μl，4 ℃，避光孵育 30 min。再次用PBS洗滌2次，棄上清液，加入300 μl的PBS，混勻細胞，制成單細胞懸液。將樣本上樣于流式細胞儀，檢測 FITC標記細胞和PE標記細胞各占細胞總數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理，結果以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 BMMSCs培養(yǎng)傳代細胞形態(tài)學變化 在倒置顯微鏡下，剛接種的BMMSCs呈圓形或球形，體積小，折光性強（圖1a）。3 d后首次換液大部分細胞貼壁，體積較小，形態(tài)多樣，大部分細胞為橢圓形、短梭形，也有三角形和/或星形細胞，且伸出長短不一、粗細不等的胞質突起互相連接（圖1b）。7 d后，細胞快速增殖，形成大小不一的細胞集落，細胞數(shù)量明顯增多，體積增大，以長梭形為主，呈放射狀向四周擴展（圖1c）。傳代后細胞生長旺盛，呈長梭形、旋渦狀生長，且細胞形態(tài)均一，趨向一致（圖1d）。

圖1 BMMSCs培養(yǎng)傳代細胞形態(tài)變化

2.2 BMMSCs表面抗原鑒定結果 對傳至第4代的BMMSCs進行鑒定，采用流式細胞儀檢測BMMSCs表面抗原CD44和CD45，結果顯示：BMMSCs CD44陽性表達率為（89.98±1.29）%，CD45陽性表達率為（2.14±0.22）%（圖2）。此結果與文獻報道一致。提示采用聯(lián)合法分離大鼠骨髓間充質干細胞，經過傳代培養(yǎng)擴增，可以得到純化的BMMSCs。

3 討 論

BMMSCs是骨髓中的非造血干細胞，主要來源于中胚層，在骨膜、肌肉和外周組織中均有存在，以骨髓和臍血中含量最多，但也只占骨髓有核細胞的0.001%～0.01%。因臍血涉及倫理學問題，且不易采取，故從骨髓中分離、純化和擴增BMMSCs就顯得非常重要[1，6]。 最初 Friedenstein[7]建立 BMMSCs 的分離方法是利用貼壁法分離得到。但隨著BMMSCs研究的深入，對細胞需求增加，快速獲得足夠的BMMSCs是各項研究的基礎。目前比較常用的分離純化方法是貼壁分離法和密度梯度離心法，流式細胞篩選和免疫磁珠分離法因操作繁瑣，且易損傷細胞，影響細胞的生物學功能而較少使用。

圖2 BMMSCs表面抗原表達

筆者通過充分沖洗大鼠骨髓腔獲取最大量骨髓后，用淋巴細胞分離液通過密度梯度離心法分離出單個核細胞，然后利用BMMSCs易于貼壁的特點，通過換液培養(yǎng)去除懸浮不貼壁的細胞。隨著培養(yǎng)時間的延長，懸浮不貼壁的細胞隨換液而不斷被清除，而BMMSCs因貼壁生長得以純化。通過觀察BMMSCs形態(tài)學變化和流式細胞儀檢測BMMSCs表面陽性和陰性標志物來進行鑒定。從形態(tài)學上來鑒別：骨髓造血干細胞多呈圓形，而BMMSCs呈細長梭形，核大，且在培養(yǎng)傳代過程中，體積逐漸增大，并形成細胞集落，排列緊密，走向趨于均勻一致。在分離培養(yǎng)的BMMSCs中，雖然含有部分造血細胞，但因其不貼壁懸浮在培養(yǎng)液中，在換液時可以逐步去除，少量造血細胞也能貼壁，但增殖緩慢，在消化傳代時脫壁速度比BMMSCs慢，因此通過消化傳代的方法也可逐漸將其去除，傳至第4代基本可達到純化目的。

另外一種方法就是通過流式細胞儀檢測細胞表面標志抗原間接鑒定BMMSCs。目前研究BMMSCs 表達 CD29、CD44、CD71、CD105、CD166等，而不表達 CD14、CD31、CD34、CD45 等[2-5]。 朱勇等[8]采用直接貼壁法分離培養(yǎng)BMMSCs，通過流式細胞儀檢測BMMSCs表面標志抗原CD90、CD45進行鑒定，流式細胞儀檢測結果顯示第3代BMMSCs表面標記物CD90和CD45陽性表達率分別為99.8%和6.8%，提示BMMSCs表達CD90而不表達CD45。倪玉霞等[9]對全骨髓貼壁培養(yǎng)法和密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs的純度進行比較，流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD34、CD44、CD45、CD29、CD90及CD11b。結果顯示兩種方法分離培養(yǎng)的BMMSCs均表達CD44、CD29和CD90，不表達CD34、CD45和CD11b。密度梯度離心法分離培養(yǎng)出的BMMSCs較全骨髓貼壁培養(yǎng)法純度高，但全骨髓貼壁培養(yǎng)法能夠縮短原代細胞培養(yǎng)時間，提高效率。Zhang等[10]將分離的大鼠BMMSCs利用表面抗原CD54和CD90進行免疫磁珠分選，經流式細胞儀檢測證實可以獲得高表達CD54和CD90，而不表達CD45的高純度的BMMSCs。也有研究者采用檢測細胞基因的方法來鑒定BMMSCs[11]。

筆者選擇檢測BMMSCs陽性標志抗原CD44和陰性標志抗原CD45相結合的方式進行鑒定，其結果顯示BMMSCs CD44陽性表達率為 （89.98±1.29）%，CD45陽性表達率為（2.14±0.22）%。 此結果與相關文獻報道一致。提示采用密度梯度離心法和貼壁分離法聯(lián)合分離純化大鼠BMMSCs，經過傳代培養(yǎng)擴增，可以得到純化的BMMSCs。

[1]Pittenger MF,Martin BJ.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics[J].Circ Res,2004,95(1):9220.

[2]Arufe MC,De la Fuente A,Fuentes I,et al.Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes[J].J Cell Biochem,2010,111(4):834-45.

[3]Barry FP,Boynton RE,Haynesworth S,et al.The monoclonal antibody SH-2,raised against human mesenchymal stem cells,recognizes an epitope on endoglin(CD105)[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,265(1):134-9.

[4]Campagnoli C,Roberts IA,Kumar S,et al.Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood,liver,and bone marrow[J].Blood,2001,98(8):2396-402.

[5]Kim J,Lee Y,Kim H,et al Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells[J].Cell Prolif,2007,40(1):75-90.

[6]Liu W,Cui L,Cao Y.Bone reconstruction with bone marrow stromal cells[J].Methods Enzymol,2006,420(4):362-80.

[7]Friedenstein AJ.Stromal mechanisms of bone marrow:cloning in vitro and retransplantation in vivo[J].Haematol Blood Transfus,1980,25(1):19-29.

[8]朱 勇，陳良萬，林若柏，等.SD大鼠骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)、表型鑒定及標記[J].吉林大學學報(醫(yī)學版)，2009,35(2):326-330.

[9]倪玉霞，李澎，李貽奎，等.大鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定[J]. 廣西醫(yī)科大學學報，2009，26(1)：10-13.

[10]Zhang L,Chan C.Isolation and enrichment of rat mesenchymal stem cells(MSCs)and separation of single-colony derived MSCs[J].J Vis Exp,2010,doi:10.3791/1852.

[11]Kim DH,Yoo KH,Choi KS,et al.Gene expression profile of cytokine and growth factor during differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cell[J].Cytokine,2005,31(2):119-26.