不同劑量X線輻射對(duì)骨肉瘤HOS細(xì)胞中端粒酶的影響

張海玉，單玉興，高 輝，丁福鵬，王 井＊

（1．吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部第一醫(yī)院 小兒外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2．吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部第一醫(yī)院二部 骨科，吉林 長(zhǎng)春130021）

骨肉瘤（成骨肉瘤）是最常見(jiàn)的惡性骨腫瘤。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，發(fā)病率很高，占原發(fā)惡性骨腫瘤的22．36%。典型骨肉瘤一般見(jiàn)于10－20歲年齡段，但在任何年齡段都可發(fā)生，包括嬰幼兒，兒童以及老年人。男性發(fā)病率較高，男女之比約2∶1。具有很強(qiáng)的局部浸潤(rùn)能力和肺轉(zhuǎn)移能力。雖然手術(shù)和化療的應(yīng)用使骨肉瘤的預(yù)后有很大的提高，但是很多患者因耐藥而預(yù)后不好。端粒酶在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生，發(fā)展中所起的作用已被人們廣泛的認(rèn)可。大量的研究表明，90%以上的腫瘤細(xì)胞都具有較高的端粒酶活性，而多數(shù)的體細(xì)胞則缺少端粒酶活性。這便給了人們攻克腫瘤的希望，放射生物學(xué)研究表明，電離輻射作用后可改變細(xì)胞周期的進(jìn)程［1，2］，但是射線照射后骨肉瘤細(xì)胞中的端粒酶活性報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究不同劑量的X射線輻射對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中端粒酶活性的影響，為放射治療骨肉瘤的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤HOS細(xì)胞系，購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)基為含10%滅活小牛血清的高糖含酚紅DMEM（GIBCO公司），內(nèi)含100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素。將每孔以1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，以備照射。

1．2 X射線

X射線能量為6MeV／u，靶皮距100cm，劑量率2Gy／min，設(shè)定細(xì)胞吸收劑量為0Gy（對(duì)照細(xì)胞）、1、2、4和8Gy。每個(gè)劑量點(diǎn)設(shè)3個(gè)平行樣，全部過(guò)程在室溫下進(jìn)行。細(xì)胞照射后，立即更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72h。

1．3 輻射敏感性測(cè)定

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活。繼續(xù)培養(yǎng)72h后每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μl，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl DMSO，振蕩10min。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（survival fraction，SF）計(jì)算公式為：sF（%）＝（實(shí)驗(yàn)組OD值／對(duì)照組OD值）×100%。最后以3個(gè)平行樣品的sF均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）繪制劑量－存活曲線。

1．4 指標(biāo)檢測(cè)

1．4．1 端粒酶活性測(cè)定 用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)端粒酶活性。Elisa試劑盒來(lái)源于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。將被檢樣品以1∶50，1∶100，1∶200，1∶400建立濃度梯度，將稀釋好的樣品加入酶標(biāo)反應(yīng)孔中，每樣品加3孔，每孔100μl，依據(jù)Elisa試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作，檢測(cè)端粒酶活性。

1．4．2 端粒酶逆轉(zhuǎn)率酶（hTERT）測(cè)定 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)hTERT的表達(dá)情況。SP試劑盒來(lái)源于北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。用4%的多聚甲醛磷酸緩沖液固定細(xì)胞爬片10－20min，干燥后PBS沖洗3次。然后具體操作依照試劑盒說(shuō)明。應(yīng)用image pro plus軟件對(duì)免疫組化圖像進(jìn)行半定量分析。

1．4．3 端粒酶RNA測(cè)定 RT－PCR檢測(cè)端粒酶基因的表達(dá)：按Trizol Reagent RNA提取試劑提取總RNA。測(cè)定端粒酶RNA的兩條引物序列分別為：5′－ACCACCAGCGTGTCTGGAGCAAGCCCA AC－3′和 5′－GGGCAACGAAGCGGAGTCGCTGGCACTG－3′，RT－PCR的 產(chǎn) 物用1．5%的瓊脂糖凝膠電泳。葡萄糖－3－磷酸脫氫酶作為內(nèi)對(duì)照。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3．1 X線照射后細(xì)胞存活

細(xì)胞存活曲線描述了輻射吸收劑量與細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系。用MTT法測(cè)定，設(shè)3個(gè)平行樣，細(xì)胞存活曲線按對(duì)數(shù)標(biāo)度繪制。（見(jiàn)圖1）。骨肉瘤HOS細(xì)胞的存活明顯降低，而且未見(jiàn)明顯的后期細(xì)胞增殖。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，細(xì)胞的存活率與輻照劑量呈負(fù)相關(guān)（P＜0．01）。

圖1 不同劑量X線照射后72h細(xì)胞存活曲線

3．2 X線照射后端粒酶活性

細(xì)胞受照后72h進(jìn)行端粒酶提取和 酶聯(lián)免疫法端粒酶活性檢測(cè)（見(jiàn)圖2）。由圖可知其端粒酶活性隨輻照劑量增加而增高。其中，輻射劑量在1 Gy、2Gy處，其端粒酶活性較對(duì)照組升高相對(duì)較??；輻射劑量在4Gy處，端粒酶活性最強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組，且增長(zhǎng)勢(shì)頭強(qiáng)勁；而輻射劑量在8Gy處，端粒酶活性仍高于對(duì)照組，但是增長(zhǎng)勢(shì)頭明顯回落，可能與細(xì)胞存活率明顯下降有關(guān)，可能與細(xì)胞增殖受到明顯抑制有關(guān)。

圖2 不同劑量X線照射后72h細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性比較

3．3 X線照射后hTERT檢測(cè)

應(yīng)用Image P ro Plus 5．0軟件對(duì)免疫組化圖像分析表明各圖像灰度值逐漸降低，亦說(shuō)明各圖像蛋白含量逐漸增高。表格數(shù)據(jù)顯示實(shí)驗(yàn)組的hTERT表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，且表達(dá)強(qiáng)度明顯與劑量呈正相關(guān)（見(jiàn)表1）。

表1 免疫組化圖像灰度值分析

3．4 X線照射后端粒酶RNA的表達(dá)

抽取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的端粒酶RNA，應(yīng)用RTPCR技術(shù)。（見(jiàn)圖3）照射后，骨肉瘤HOS細(xì)胞內(nèi)端粒酶RNA高表達(dá)，在4Gy時(shí)，電泳條帶亮度最高，說(shuō)明樣品含量最大?？傮w來(lái)看，很明顯樣品含量與劑量呈正相關(guān)。

圖3 不同劑量X線照射后72h端粒酶RNA水平

4 討論

放射治療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，尤以X線最為普遍應(yīng)用。經(jīng)放射治療后，正常細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞獲得同樣的殺傷效果，但是由于惡性腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足和增殖機(jī)制不完善，與正常組織相比，它的組織修復(fù)能力相對(duì)較差。這是放射治療的基本原理。

端粒酶是腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的基礎(chǔ)，除了少數(shù)的造血干細(xì)胞，生殖細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞及皮膚基底層細(xì)胞等增殖細(xì)胞外，正常細(xì)胞內(nèi)無(wú)端粒酶。hTERT是端粒酶的蛋白質(zhì)亞單位，與端粒酶的活性高低密切相關(guān)，是端粒酶延長(zhǎng)端粒的關(guān)鍵酶。人類的端粒酶有3個(gè)亞基，包括人端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT），前兩種成分在端粒酶陰性的正常組織中廣泛表達(dá)，而hTERT僅在端粒酶陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。腫瘤細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有hTERT，端粒酶無(wú)法維持端粒的長(zhǎng)度。眾多研究表明，端粒酶活性降低的關(guān)鍵是hTERT活性的下調(diào)；端粒酶激活的主要途徑也是hTERT的表達(dá)的增強(qiáng)。

細(xì)胞內(nèi)的DNA是放射線的靶點(diǎn)。X線進(jìn)入人體后，產(chǎn)生的次級(jí)電子可直接擊中細(xì)胞內(nèi)的DNA雙鏈，使其產(chǎn)生單鏈或雙鏈斷裂。水分子受到射線作用后發(fā)生電離而產(chǎn)生自由基，自由基和有毒成分對(duì)DNA分子產(chǎn)生破壞作用，達(dá)到殺死細(xì)胞的作用。

本實(shí)驗(yàn)表明，隨著X線劑量的增加，端粒酶活性，hTERT及端粒酶RNA的表達(dá)均增高且大致同步。其中，在1Gy、2Gy處，端粒酶活性，hTERT和端粒酶RNA表達(dá)較對(duì)照組升高相對(duì)較小，但細(xì)胞存活率較高，這可能是射線量低，沒(méi)能達(dá)到致死腫瘤細(xì)胞的程度；當(dāng)輻射劑量達(dá)4Gy、8Gy時(shí)，端粒酶活性，hTERT和端粒酶RNA表達(dá)較對(duì)照組升高非常明顯，細(xì)胞存活率急劇下降，可能是射線量達(dá)到了致死腫瘤細(xì)胞的程度，腫瘤細(xì)胞需要調(diào)動(dòng)所有機(jī)制阻止細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序，hTERT和端粒酶RNA表達(dá)增強(qiáng)，端粒酶異?；钴S。也可能是射線損傷了端粒，使端粒酶活性增強(qiáng)，但端粒酶活性的增強(qiáng)最終也沒(méi)能夠阻止骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。雖然在8Gy時(shí)，端粒酶活性，hTERT及端粒酶RNA含量比4Gy時(shí)的增長(zhǎng)勢(shì)頭有所降低，但仍強(qiáng)于對(duì)照組。說(shuō)明在8Gy是，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的端粒酶，hTERT和端粒酶RNA含量的比例較其他樣品均高。這些數(shù)據(jù)表明，在x射線的干擾下：X射線劑量與骨肉瘤細(xì)胞存活率呈負(fù)相關(guān)；X射線劑量與端粒酶活性呈正相關(guān)；骨肉瘤細(xì)胞存活率與端粒酶活性呈負(fù)相關(guān)；hTERT，端粒酶RNA和端粒酶活性三者屬同步關(guān)系。

5 結(jié)論

也有實(shí)驗(yàn)表明端粒酶活性水平并不與照射后細(xì)胞的存活水平平行，但是端粒酶活性變化與輻照所用的射線及輻照劑量有關(guān)已成共識(shí)。中小劑量照射后細(xì)胞死亡數(shù)隨著照射劑量的增加而增加，而修復(fù)反應(yīng)明顯，常表現(xiàn)出酶活性的增高。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能否真實(shí)地反映放療對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷性，是否能夠確定放療對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的療效，還不能確定；端粒酶是否參與放射誘發(fā)的損傷修復(fù)及端粒酶活性檢測(cè)，能否用于放療效果評(píng)估有待深入研究；端粒酶與放射治療的關(guān)系還有待進(jìn)一步探討。

［1］Teyssier F，Bay JO，Dionet C，et al．Cell cycle regulation after exposure to Ionizing radiation［J］．J Bull Cancer，1999，86：345．

［2］Hwang A，Muschel RJ．Radiation and the phase of the cell cycle［J］．J Radiat Res，1998，150：52．