單體、寡聚體及纖維狀A(yù)β毒性作用的比較研究

孔繁軍，陳 強，周 亮，崔德華＊

（1．北京海淀醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，北京100080；2．寧波市北侖宗瑞醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；3．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 神經(jīng)科學(xué)研究所）

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種發(fā)生于老人的最常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學(xué)特征則是在腦中形成大量的老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及出現(xiàn)彌漫性腦萎縮［1］。其病因發(fā)病機制的研究1984年，Glenner and Wong從老年斑中純化和分離得到Aβ并解讀得到其蛋白序列［1］，才開始有了顯著的進展。隨后的研究表明老年斑的主要成分是β－淀粉樣蛋白（β－amyloid peptide，Aβ），由β－淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）裂解產(chǎn)生，Aβ的寡聚體和纖維化是AD患者腦內(nèi)重要的病理改變，在凝聚形成Aβ纖維的過程中，具有過氧化損傷，引起炎癥反應(yīng)，損傷突觸功能等多種神經(jīng)毒性，對AD的病理進程起關(guān)鍵作用［2］。本實驗采用單體、寡聚體及纖維化Aβ?lián)p傷大鼠海馬CA1區(qū)來制備AD大鼠模型，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測AD大鼠不同腦區(qū)細(xì)胞凋亡情況。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 選取雄性Wistar大鼠64只，鼠齡3－4個月，體重200－250g，大鼠隨機分為Aβ組、生理鹽水組及假手術(shù)對照組，每組16只。

1．2 不同種類 Aβ制備［5］將 Aβ1－40溶于滅菌過的超純水，配成500μmol·L－1儲存液分裝，于－20℃凍存。寡聚體Aβ使用前于37℃孵育48h，纖維狀A(yù)β使用前于37℃孵育21d。不同類型Aβ使用AFM法觀察確認(rèn)寡聚體Aβ和纖維狀A(yù)β。單體Aβ1－40不在37℃孵育7d，凍結(jié)后馬上使用。采用核黃素標(biāo)記光度法測定Aβ凝聚度。

1．3 動物模型的制作 用10%水合氯醛腹腔注射（0．3－0．35ml／100g）麻醉大鼠。將頭部固定在立體定位儀上，頭背中部縱向切口，暴露顱骨，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選右側(cè)海馬為注射區(qū)，定位坐標(biāo)：前囟后3．0mm，中線右側(cè)2．0mm，硬膜下2．6 mm。鉆開顱骨，分離暴露硬腦膜，垂直進針至靶點，緩慢注射5μl寡聚體 Aβ1－40（濃度為1μg／μl，預(yù)先37℃下孵育1w），注射時間為5min，留針5 min，保證溶液充分彌散，撤針，縫合切口，所有操作均在無菌條件下進行。假手術(shù)組切開硬腦膜后即縫合傷口。Aβ組、生理鹽水組及假手術(shù)對照組用生理鹽水按等量代替。

1．4 不同Aβ對海馬細(xì)胞凋亡 （1）制備單細(xì)胞懸液：術(shù)后7d各組取5只大鼠，處死動物，在冰盤上快速取新鮮海馬、額葉、顳葉約0．2g，0．1MPBS（pH7．4）洗滌，剪碎，0．3%胰蛋白酶3．0ml，37℃消化30min，在PBS中洗滌、吹打成單細(xì)胞懸液，200目尼龍網(wǎng)過濾，－20℃預(yù)冷的無水乙醇3ml中固定，4℃保存?zhèn)溆?。?）細(xì)胞凋亡百分率測定［5］：細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106個，加100μl RNAse 37℃水浴30min，加入PI染色液800μl混勻，4℃避光30 min，上機進行FCM檢測，測定數(shù)據(jù)按FAC Scan所配置的ModFit軟件進行分析，以細(xì)胞周期各時相以及AP區(qū)亞峰細(xì)胞百分率記錄數(shù)據(jù)。

1．5 采用核黃素標(biāo)記光度法測定Aβ凝聚方法 參照我們已發(fā)表JBC論文的方法測定Aβ凝聚［5］。

2 結(jié)果

2．1 不同的Aβ的β凝聚度

Aβ隨時間依賴性凝聚度增強。單體Aβ與寡聚體Aβ組間數(shù)值間有顯著差異（P※※＜0．01），并且纖維化Aβ與寡聚體Aβ組間數(shù)值間有顯著差異（P※※＜0．01），見圖1。

圖1 不同的Aβ的β凝聚度

2．2 不同的Aβ對海馬細(xì)胞凋亡的變化 對照組與單體Aβ組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）；多聚體Aβ組與單體及纖維化Aβ、對照組數(shù)值間有顯著差異（P※※＜0．01），寡聚體Aβ組海馬含G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯升高，見圖2。

此結(jié)果說明單體Aβ沒有毒性，寡聚體Aβ對海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性最大，但是轉(zhuǎn)化成纖維化Aβ，則神經(jīng)毒性反而降低。

圖2 表示不同的Aβ對海馬細(xì)胞的毒性作用。mo－Aβ，單體Aβ；o－Aβ，寡聚體Aβ；f－Aβ，纖維化 Aβ，各組n＝5，＊＊P＜0．01。

2．3 不同的Aβ的β凝聚度和海馬神經(jīng)細(xì)胞的死亡之間的關(guān)系

為了闡明Aβ的β凝聚性對神經(jīng)細(xì)胞的毒性之間的關(guān)系，對單體Aβ，寡聚體Aβ及纖維化Aβ組的凝聚度和細(xì)胞毒性做了相關(guān)分析。結(jié)果顯示Aβ凝聚度與海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性無正相關(guān)，即并不是凝聚度越高毒性越大，反而纖維化Aβ毒性下降。此結(jié)果進一步支持寡聚體Aβ在AD發(fā)生起關(guān)鍵作用。

3 討論

AD是一種導(dǎo)致老年性癡呆的常見疾病，其臨床特征主要為進行性記憶減退、言語和行為障礙，AD的病因和發(fā)病機制還不十分清楚。但目前認(rèn)為Aβ是AD老年斑的核心成分，被認(rèn)為是多種原因?qū)е翧D的共同通路［1］。我們采用經(jīng)體外孵育的凝聚狀態(tài)的Aβ1－40海馬CA1區(qū)立體定向注射建立AD動物模型，以往的實驗結(jié)果表明單側(cè)海馬CA1區(qū)注射后1周的Aβ組大鼠明顯表現(xiàn)出記憶獲得和記憶再現(xiàn)的損傷作用，形態(tài)學(xué)觀察證明在Aβ腦內(nèi)可引起神經(jīng)元的凋亡，說明Aβ海馬區(qū)注射Aβ1－40建立的模型比較符合AD的自然病理過程。

本實驗采用FCM以碘化丙啶（PI）為特異性熒光探針標(biāo)記細(xì)胞，單參數(shù)分析細(xì)胞內(nèi)DNA相對含量，對Aβ1－40海馬CA1區(qū)損傷大鼠不同腦區(qū)腦組織所制作的單細(xì)胞懸液進行凋亡百分率檢測，結(jié)果提示，Aβ組凋亡百分率明顯升高，與其它各組比較差異明顯，說明Aβ神經(jīng)毒性可致神經(jīng)細(xì)胞凋亡性改變。

脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶以模板依賴性方式催化用熒光素或同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸與DNA片段游離3－OH末端發(fā)生聚合反應(yīng)，用于標(biāo)記DNA鏈斷片，然后進行或同位素檢測。TUNEL法實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征，可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度較高［2］。

Aβ與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切［3］，在培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中加入Aβ后神經(jīng)元出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡典型形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征［6］。在APP717轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ廣泛沉積，大量神經(jīng)元發(fā)生凋亡，同時伴有P53蛋白表達的增加［7］。將 Aβ1－40注射到成年小鼠腦內(nèi)，海馬可見到明顯細(xì)胞丟失，而在Caspase－3基因缺失小鼠，則細(xì)胞丟失不明顯［8］。本實驗結(jié)果用FCM和TUNEL法證明在Aβ腦內(nèi)可引起神經(jīng)元的凋亡，支持細(xì)胞凋亡參與了AD發(fā)病的觀點。

AD發(fā)病機制中涉及細(xì)胞凋亡有關(guān)的多個環(huán)節(jié)［9］。老年斑的主要成分寡聚體Aβ激活Caspases，一組啟動和執(zhí)行凋亡的蛋白水解酶，導(dǎo)致細(xì)胞核和細(xì)胞骨架蛋白的裂解，其中Tau蛋白的降解是神經(jīng)纖維變性的關(guān)鍵［10］。Aβ的神經(jīng)毒性作用可直接或間接損傷線粒體膜而使膜電位下降，PT孔的開啟可以引發(fā)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要事件［11］，如線粒體內(nèi)Ca2＋的釋放及質(zhì)子的滲漏、細(xì)胞色素C的釋放、Caspases激活因子的釋放、細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變，Bcl－2家族促進和抑制凋亡蛋白的參與等。不同信號的傳導(dǎo)最終集中到線粒體上來啟動或抑制這些事件及其效應(yīng)的產(chǎn)生［12］。

Aβ寡聚體比單體及纖維化Aβ毒性顯著增高，因此，防止Aβ寡聚體化可抑制凋亡蛋白的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可能對減輕神經(jīng)系統(tǒng)的損害提供新的思路和策略。

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