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    嘌呤核苷酸對(duì)海洛因依賴及戒斷大鼠垂體嘌呤核苷酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

    2012-10-09 03:56:12崔佳樂洪新雨趙麗艷劉劍凱
    關(guān)鍵詞:海洛因吉林大學(xué)嘌呤

    崔佳樂,洪新雨,趙麗艷,,劉劍凱,洪 敏*

    (1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,吉林 長春130021;

    2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長春130021;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科,吉林 長春130041;4.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,吉林 長春130021)

    毒品的濫用成癮是嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題,海洛因是具有代表性的阿片類毒品,對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的器官都有較嚴(yán)重的毒性和潛在的危害[1,2],神經(jīng)系統(tǒng)常受損嚴(yán)重。以往的研究表明海洛因可造成機(jī)體嘌呤核苷酸的分解代謝增強(qiáng),表現(xiàn)為血尿酸明顯增高[3],并且發(fā)現(xiàn)阿片類藥物使大鼠大部分組織器官中次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)的基因表達(dá)下降,同時(shí)給予腺苷或嘌呤核苷酸則可逆轉(zhuǎn)或緩解阿片類物質(zhì)所致的某些損害[4-6]。有學(xué)者報(bào)道ATP和它的代謝產(chǎn)物通過激活腺苷和/或嘌呤受體而調(diào)節(jié)下丘腦功能,這些受體表達(dá)在神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞,包括下丘腦神經(jīng)元,有分泌作用的垂體細(xì)胞和支持細(xì)胞[7]。這些都提示核苷酸的代謝情況會(huì)與海洛因成癮及戒斷情況下垂體的功能狀態(tài)密切相關(guān)。本文通過檢測(cè)海洛因成癮、戒斷及補(bǔ)償嘌呤核苷酸大鼠垂體嘌呤核苷酸代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)情況的變化,觀察海洛因?qū)︵堰屎塑账岽x的影響,及嘌呤核苷酸的治療干預(yù)作用,為探討補(bǔ)償嘌呤核苷酸作為海洛因戒癮的新療法及其將來應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物、藥品及試劑

    實(shí)驗(yàn)選用清潔級(jí)健康成年雄性Wistar大鼠80只,體重為200±20g,由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):吉檢證字第2003-0001號(hào))。海洛因(純度98%)由吉林省公安廳禁毒辦公室提供,臨用時(shí)用生理鹽水溶解、抽濾除菌。嘌呤核苷酸:腺苷一磷酸(adenosine monophosphate,AMP),鳥苷一磷酸(guanosine monophosphate,GMP)為 AMRESCO公司產(chǎn)品。PCR引物:特異引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,引物設(shè)計(jì)根據(jù)Primer 5.0設(shè)計(jì)軟件完成。β-肌動(dòng)蛋白Ⅰ(β-actinⅠ)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為511bp,上游引物:5′-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3′, 下 游 引 物:5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGCA-3′;β-肌動(dòng)蛋白Ⅱ(β-actinⅡ)擴(kuò)增產(chǎn)物長度為218bp,上游引物:5′-AAGAGAGGCATCCTGACCCT-3′,下 游 引 物:5′-TACATGGCTGGGGTGTTGAA-3′;ADA 引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度 為 258bp,上 游 引 物:5′-GCAACATTATCGGCATGGAC-3′,下 游 引 物:5′-CAAGATCCACAACCTCATCAG-3′;HGPRT引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為410bp,上游引物:5′-GCTGACCTGCTGGATTACATTA-3′,下 游 引 物:5′-CCACTTTCGCTGATGACACAA-3′。

    1.2 動(dòng)物分組與給藥

    80只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成8組,每組10只,喂食普通固體飼料,自由飲水,同條件飼養(yǎng),自然晝夜采光。①對(duì)照組(C):第1-10天每日2次腹腔注射生理鹽水,注射體積及時(shí)間與當(dāng)日海洛因給藥體積及時(shí)間相同,第11天處死。②核苷酸組(N):第1-10天每日2次(AM7:00和PM19:00)腹腔注射核苷酸(AMP與GMP等摩爾混合),每日次劑量均為7.5mg·kg-1體重,第11天處死。③海洛因組(H):第1-10天每日2次(AM7:00和PM19:00)腹腔注射海洛因,每日次劑量依次為0.50、0.75、1.25、2.00、3.00、4.25、5.75、7.50、7.50和7.50mg·kg-1體重,第11天處死。④海洛因+核苷酸組(NH):第1-10天每日2次(AM7:00和PM19:00)腹腔注射核苷酸和海洛因(核苷酸劑量同當(dāng)日核苷酸組,海洛因劑量同當(dāng)日海洛因組),第11天處死。⑤海洛因戒斷3d組(W3):第1-10天每日2次腹腔注射海洛因(同海洛因組),第11-13天停藥,第14天處死。⑥海洛因戒斷9d組(W9):第1-10天每日2次腹腔注射海洛因(同海洛因組),第11-19天停藥,第20天處死。⑦核苷酸3d組(N3):第1-10天每日2次腹腔注射海洛因(同海洛因組),第11-13天每日2次腹腔注射核苷酸(給藥劑量及時(shí)間同核苷酸組),第14天處死。⑧核苷酸9d組(N9):第1-10天每日2次腹腔注射海洛因(同海洛因組),第11-19天每日2次腹腔注射核苷酸(給藥劑量及時(shí)間同核苷酸組),第20天處死。

    1.3 RT-PCR法檢測(cè)垂體組織的 ADA mRNA和HGPRT mRNA含量

    異硫氰酸胍法提取大鼠垂體組織的總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR反應(yīng)在0.2ml Eppendorf管中建立反應(yīng)混合物包括:10×PCR Buffer 5μl,dNTP(10mmol·L-1)1μl,β-actin上下游引物各10pmol,ADA和HGPRT的PCR反應(yīng)上下游引物(ADA的PCR反應(yīng)上下游引物各50pmol,HGPRT的PCR反應(yīng)上下游引物各10pmol),cDNA 1 μl,Taq DNA聚合酶(5U·μl-1)0.5μl,加三蒸水補(bǔ)足體積至50μl。ADA擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件:①95℃,3min;②95℃,35s;③64℃,1min;④72℃,1 min;⑤重復(fù)步驟②-④,34個(gè)循環(huán);⑥72℃,10 min。HGPRT擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件:①95℃,3 min;②95℃,35sec;③58℃,1min;④72℃,1min;⑤重復(fù)步驟②-④,27個(gè)循環(huán);⑥72℃,10min。RT-PCR產(chǎn)物的定量鑒定:PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,溴化乙錠染色后用Kodak凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳結(jié)果的拍照及電泳條帶的強(qiáng)度分析,分別計(jì)算每一條泳道的目地基因擴(kuò)增產(chǎn)物與內(nèi)參β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度比值,表示該目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件,垂體組織的ADA mRNA及HGPRT mRNA含量以ˉx±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠垂體組織中ADA基因表達(dá)水平

    與對(duì)照組比較,海洛因組、戒斷3d組大鼠垂體ADA mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值上有所增高,但各組均未見明顯差異(P>0.05)。見圖1,表1。

    2.2 各組大鼠垂體組織中HGPRT基因表達(dá)水平

    與對(duì)照組比較,核苷酸組HGPRT mRNA增多(P<0.05),海洛因組未見到顯著改變(P>0.05)。見圖1,表1。

    圖1 各組大鼠垂體組織中ADA和HGPRT基因表達(dá)水平

    表1 各組大鼠垂體組織中ADA和HGPRT基因表達(dá)水平(n=3,x—±s,λB/U·L-1)

    3 討論

    嘌呤核苷酸(AMP和GMP)作為RNA/DNA的組成成分,是細(xì)胞內(nèi)非常重要的分子,同時(shí)在細(xì)胞間嘌呤核苷與核苷酸又是遞質(zhì),通過嘌呤能受體引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞,參與幾乎所有的生命活動(dòng)。腺苷脫氨酶(adenosine deaminase,ADA)是降解嘌呤核苷酸的關(guān)鍵酶之一,催化腺嘌呤核苷轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷,進(jìn)而分解成次黃嘌呤。次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,HGPRT)是嘌呤核苷酸補(bǔ)救合成關(guān)鍵酶,由于在腦組織內(nèi)嘌呤核苷酸僅有補(bǔ)救合成途徑,因而HGPRT的作用很重要。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,海洛因組、海洛因戒斷3d組大鼠垂體ADA mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值上有所增高,海洛因戒斷9d組又下降,但各組均未見明顯差異(P>0.05)。這種變化的趨勢(shì)與以往文獻(xiàn)中睪丸、附睪組織相似[8],但不同在于幅度較小。同時(shí),與對(duì)照組比較,核苷酸組、核苷酸3d組、及核苷酸9d組ADA mRNA相對(duì)表達(dá)量的數(shù)值相近,也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)??梢杂^察到海洛因成癮和戒斷時(shí),同時(shí)給予嘌呤核苷酸能夠使ADA mRNA水平保持相對(duì)的穩(wěn)定。

    同時(shí),與對(duì)照組比較,除核苷酸組HGPRT mRNA增多(P<0.05),其他各組未見到顯著改變(P>0.05)。雖然相對(duì)于對(duì)照組,海洛因組 HGPRT mRNA水平較低,但海洛因戒斷3d組數(shù)值上升,說明可能對(duì)于不同的酶,海洛因作用的起效時(shí)間有所差異。且在海洛因戒斷的同時(shí)給予嘌呤核苷酸(即核苷酸3d組),HGPRT mRNA水平更加接近于對(duì)照組。這提示補(bǔ)償核苷酸組依然表現(xiàn)出“對(duì)抗”海洛因的作用。

    以往的研究表明,海洛因給藥加強(qiáng)了多種組織內(nèi)嘌呤核苷酸的分解,并且降低了補(bǔ)救合成[3],繼而導(dǎo)致了嘌呤核苷酸的代謝失衡。由于腦組織的特殊性,其內(nèi)部僅有嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成,而缺乏從頭合成,使得腦組織內(nèi)嘌呤核苷酸缺失。研究認(rèn)為補(bǔ)償嘌呤核苷酸恰恰可以抑制這種缺失情況,從而抵抗了海洛因依賴導(dǎo)致的各種毒副作用[4]。同時(shí)海洛因依賴會(huì)使包括垂體的多種組織內(nèi)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)造成損害[8],而補(bǔ)償嘌呤核苷酸后可以緩解或抑制這種損害。海洛因成癮及戒斷的情況很復(fù)雜,同時(shí)補(bǔ)償嘌呤核苷酸是否可能從多個(gè)途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)和作用,垂體內(nèi)嘌呤核苷酸的代謝情況及具體作用機(jī)制還有待于深入的研究。

    [1]Goletiani NV,Mendelson JH,Sholar MB,et al.Opioid and cocaine combined effect on cocaine-induced changes in HPA and HPG axes hormones in men[J].Pharmacol Biochem Behav,2009,91(4):526.

    [2]Graziani M,Antonilli L,Togna AR,et al.Non-opioid induction of morphine-6-glucuronide synthesis is elicited by prolonged exposure of rat hepatocytes to heroin[J].Drug Alcohol Depend,2008,98(3):179.

    [3]Yang YD,Zhang JZ,Sun C,et al.Heroin affects purine nucleotides catabolism in rats in vivo[J].Life Sci,2006,78(13):1413.

    [4]闞慕潔.嘌呤核苷酸補(bǔ)償對(duì)阿片類藥物與毒物作用的干預(yù)性研究[D].長春:吉林大學(xué),2008.

    [5]何海濤,孫 婷,崔佳樂,等.嘌呤核苷酸補(bǔ)償對(duì)嗎啡依賴大鼠嘌呤核苷酸分解代謝的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2008,24(8):1081.

    [6]崔佳樂,劉昕鳴,王 巍,等.嘌呤核苷酸對(duì)海洛因依賴及戒斷大鼠心肌酶學(xué)的影響[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,35(3):474.

    [7]Stojilkovic SS.Purinergic regulation of hypothalamopituitary functions.Trends Endocrinol Metab[J].2009,20(9):460.

    [8]崔佳樂.海洛因及補(bǔ)償嘌呤核苷酸對(duì)雄性大鼠生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響[D].長春:吉林大學(xué),2008.

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