異基因造血干細胞移植受者CMV檢測方法的比較

郝新建，周 健，房佰俊，張?莉，符粵文，魏旭東，宋永平

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院血液科 河南鄭州 450052;2.鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院血液科 河南鄭州 450008)

近年來，多種免疫抑制劑聯(lián)合應用使異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)得到快速的發(fā)展。allo-HSCT受者人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，CMV)感染極為普遍［1］，活動性CMV感染是繼發(fā)曲霉菌、細菌混合感染的高危因素，且不易與細菌、真菌感染區(qū)別;其引起的間質(zhì)性肺炎是器官移植失敗重要原因之一［2］。目前更昔洛韋(GCV)的使用使CMV疾病的治療有了較大轉(zhuǎn)機，只要能找到移植后受者出現(xiàn)CMV活動的證據(jù)，雖無臨床表現(xiàn)，可給予GCV預先性治療。但取得預先性治療療效的切入點在于早期發(fā)現(xiàn)CMV活動，CMV多引起潛伏感染，早期所致疾病的臨床表現(xiàn)多為非特異性，所以早期診斷主要依靠實驗室檢查。因此，建立早期快速、靈敏特異、可靠的CMV檢測和鑒定方法，提高檢測效率是所有環(huán)節(jié)的關(guān)鍵。本研究應用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IgM抗體和熒光定量PCR(FQ-PCR)檢測血漿DNA定量，旨在比較allo-HSCT后早期有效診斷CMV感染的方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀(芬蘭)、熒光定量PCR檢測儀(日本大和公司)、人類巨細胞病毒核酸擴增熒光檢測試劑盒(羅氏公司)、巨細胞病毒IgM抗體ELISA試劑盒(上海森雄公司)。

1.2 標本來源 642份外周血標本取自2006年10月至2011年10月在我科行allo-HSCT的57名受者。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測血清IgM抗體:按試劑盒說明操作和判定結(jié)果。

1.3.2 熒光定量PCR檢測血漿DNA含量:①分離DNA:取2 ml靜脈血EDTA抗凝，1 600 r/min離心20 min;取100 μl血漿與100 μl DNA提取液1振蕩混勻，1 300 r/min離心15 min，棄上清;加入50 μl DNA提取液2，振蕩混勻，100℃沸水浴/干浴10 min，1 300 r/min離心10 min，保留上清待用。對照樣品不必加提取液。②擴增前準備:每個反應管中加入PCR反應液35.6 μl、Taq 酶 0.4 μl、UNG 0.06 μl，整個反應體系為40 μl，充分混合均勻;陰性、陽性對照管分別加 4 μl標準對照樣品，和待測試反應管一起2 000 r/min離心10 s。③PCR擴增:循環(huán)條件為37℃ 5 min;94℃ 1 min;95℃ 5 s;60℃ 40 s;42個循環(huán)。60℃收集熒光信號，增益區(qū)間根據(jù)建議值設(shè)定。以DNA負荷量＞103拷貝/ml或Ct值≤37.0為陽性。

1.3.3 活動性CMV感染診斷標準［3］:發(fā)熱伴白細胞減少，或間質(zhì)性肺炎、胃腸炎、肝炎、視網(wǎng)膜炎，抗CMV治療有效。

1.3.4 統(tǒng)計學處理:應用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗比較不同檢驗方法的結(jié)果關(guān)聯(lián)性;用 McNemer χ2檢驗比較其差異性，a=0.05 為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察和檢測結(jié)果 所觀察的57名患者中，男30例，女27例，中位年齡33(3～49)歲。慢性粒細胞白血病27例(慢性期18例，加速期6例，急變期3例，為同基因造血干細胞移植術(shù)后復發(fā)急單變)，非何杰金氏淋巴瘤3例，急性髓系白血病18例(AML-M1 6例，AML-M2 9例，AML-M53例)，急性淋巴細胞白血病6例，重型再生障礙性貧血3例。同胞HLA全相合移植33例，非血緣關(guān)系移植12例，單倍型移植9例，非血緣臍血移植3例。根據(jù)臨床診斷標準，24例患者診斷為CMV活動性感染，其DNA定量、IgM抗體擬診符合情況分別為21例和9例;3例患者DNA定量間斷性陽性，但臨床隨訪3個月后發(fā)展成為CMV病。兩種方法的陽性檢出率分別為35.51%(228/642)和13.08%(84/642)。

2.2 DNA定量、IgM抗體檢測結(jié)果二者之間關(guān)聯(lián)性和差別性分析 IgM抗體陽性檢出率明顯低于DNA定量，其差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，與DNA定量檢測雖有關(guān)系，但結(jié)合Pearson列聯(lián)系數(shù)P=0.1887，關(guān)系不太密切。DNA定量檢測法明顯優(yōu)于IgM抗體檢測法，見表1。

表1 DNA定量和IgM抗體檢測結(jié)果之間關(guān)系(n)

3 討論

CMV感染非常普遍，機體免疫功能正常時，CMV在感染細胞內(nèi)以整合狀態(tài)潛伏存在，復制水平低下，通常表現(xiàn)為無癥狀或輕微癥狀的潛伏感染。機體免疫功能受到抑制時，CMV可被再次激活，從而持續(xù)高水平地復制，進而引起一系列有嚴重臨床癥狀的CMV感染性疾病，甚至導致死亡。allo-HSCT后8～10月內(nèi)，受者白細胞雖在數(shù)量上已重建，但機體免疫功能尤其是細胞免疫尚未恢復，使體內(nèi)潛伏的CMV或經(jīng)輸血或供者細胞獲得的CMV激活，易發(fā)生CMV活動性感染。CMV活動性感染除了引起CMV間質(zhì)性肺炎外，還能誘導GVHD發(fā)生，影響干細胞植入，使造血重建延遲。

早期診斷CMV活動性感染主要依靠實驗室檢查，但目前診斷方法多種多樣，最近發(fā)展的FQ-PCR減少了潛伏感染所致的假陽性結(jié)果，成為一種受寵的方法［4］，國外將其作為器官移植受者CMV感染診斷的首選方法。FQ-PCR省去了處理擴增產(chǎn)物和冗長的電泳而檢測迅速;整個過程在完全閉管狀態(tài)進行，極大地降低了污染造成的假陽性;儀器測定產(chǎn)物的熒光信號，并自動收集、分析數(shù)據(jù)，結(jié)果客觀可靠。本研究應用FQ-PCR檢測57位患者642份標本，其中21例患者為持續(xù)陽性，DNA拷貝數(shù)持續(xù)遞增，大于103拷貝/mL，并最終發(fā)展為CMV病;經(jīng)GCV治療1～2周后DNA均轉(zhuǎn)陰。這和CMV病的臨床診斷符合率達87.5%，另有3例患者DNA定量間斷陽性，沒有預先性治療，隨訪3個月后發(fā)展為CMV病。目前本研究觀察的病例數(shù)還不多，但已經(jīng)顯現(xiàn)出DNA定量檢測的準確性。同時暗示血漿DNA定量間斷陽性的患者也應進行預先性治療。另外定量PCR能表明機體組織中CMV的含量和活動狀態(tài)以及與CMV病之間的風險關(guān)系，可預示CMV病的進程，指導臨床用藥和監(jiān)測療效。

CMV原發(fā)或潛伏-再激活感染時，體內(nèi)可產(chǎn)特異IgM，且IgM存在一般不超過16周，所以IgM一直被視為原發(fā)或活動性感染的指標。本實驗IgM的陽性檢出率較低，IgM的量不僅與病毒負荷有關(guān)，還與患者免疫功能狀態(tài)有關(guān)，allo-HSCT后免疫抑制劑的應用使免疫功能低下，影響其敏感性和特異性。因此CMV抗體測定在診斷CMV感染中的價值受到限制，盡管如此，CMV血清學檢測在干細胞移植仍不可缺少，比如D+/R+，受者極易發(fā)生CMV病。因此血清學檢測在選擇合適供者、篩選血制品、判斷患者預后方面仍有重要的價值［5］。

本研究資料顯示，F(xiàn)Q-PCR檢測血漿DNA含量是一種敏感特異、快速簡便的CMV診斷新方法，其量化結(jié)果不僅有助于早期診斷治療，而且對評估CMV感染狀態(tài)、監(jiān)測藥物療效、判斷預后和減少藥物濫用方面有重要的指導作用。

［1］Zawilinska B，Kopec J，Szostek S，et al.Lymphotropic herpesvirus DNA detection in patients with active CMV infection-a possible role in the course of CMV infection after hematopoietic stem cell transplantation［J］.Med Sci Monit，2011，17(8):432-441.

［2］Marr K A，Carter R A，Boeckh M，et al.Invasive aspergillosis in allogeneic stem cell transplant recipients:changes in epidemiology and risk factors［J］.Blood，2002，100(13):4358-4366.

［3］Zaia J A.Prevention and management of CMV-related problems after hematopoietic stem cell transplantation［J］.Bone Marrow Transplantation，2002，29(8):633-638.

［4］Hamprecht K，Witzel S，Maschmann J，et al.Rapid detection and quantification of cell free cytomegalovirus by a high-speed centrifugation-based microculture assay:comparison to longitudinally analyzed viral DNA load and pp67 late transcript during lactation［J］.J Clin Virol，2003，28(3):303-316.

［5］Razonable R R，Rivero A，Rodriguez A，et al.Allograft rejection Predicts the occurrence of Iate-onset cytomegalovirus(CMV)disease among CMV-mismatched solid organ transplant patients receiving prophylaxis with oral ganciclovir［J］.J Infect Dis，2001，184(11):1461-1464.