孔雀石綠脫色菌的分離鑒定及降解特性研究

曾慶龍， 周元祥， 劉 秀， 葉紅曼

（合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

隨著染料工業(yè)的迅速發(fā)展，染料品種和數(shù)量日益增加，它們不僅具有特定的顏色，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物可降解性較低，大多具有潛毒性特征［1］。在染料家族中，三苯甲烷染料是僅次于偶氮染料的一個(gè)大類，被廣泛地應(yīng)用于紡織印染、醫(yī)藥、造紙和制革等工業(yè)［2］?？兹甘G是一種有毒的三苯甲烷類人工合成有機(jī)化合物，既可用作生物染色劑及絲綢、皮革和紙張等的染料，也可用來(lái)治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染等，但是孔雀石綠具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變等副作用［3－4］，已被列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。因此，尋找對(duì)這類染料的特定降解菌成為人們爭(zhēng)相關(guān)注的焦點(diǎn)問題［5－9］。本文研究實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的3種菌株對(duì)孔雀石綠的降解特性，以進(jìn)一步豐富孔雀石綠染料廢水脫色處理的微生物資源，為孔雀石綠染料廢水生物脫色問題提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源及染料

（1）菌種：從實(shí)驗(yàn)室ABR反應(yīng)器中的活性污泥混合液中分離。

（2）染料：孔雀石綠，分析純，λmax＝616nm。

1.2 培養(yǎng)基

（1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏5g，蒸餾水1L，pH 7.0～7.2。

（2）選擇培養(yǎng)基：C6H12O61.5g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 1g，KH2PO42.65g，Na2HPO4·12H2O 4.26g，MgSO4·7H2O 0.2g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，CaCl20.02g，MnSO4·7H2O 0.002g，孔雀石綠60mg，蒸餾水1L，pH 7.0～7.2。

1.3 菌株分離與鑒定

將ABR反應(yīng)器中采集的活性污泥混合液，在固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上進(jìn)行稀釋涂布，再反復(fù)進(jìn)行劃線分離，獲得純菌株，將純化后的菌株接入液體培養(yǎng)基中（染料質(zhì)量濃度60mg／L，每支試管裝10mL脫色培養(yǎng)基，每株菌株接3管做3次平行試驗(yàn)），30℃培養(yǎng)一定時(shí)間，篩選出能對(duì)孔雀石綠脫色的菌株。根據(jù)細(xì)菌分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)［10］，從菌株個(gè)體形態(tài)特征、菌落特征等方面進(jìn)行初步鑒定。菌株通過16SrDNA基因序列比對(duì)，對(duì)分離菌株進(jìn)行系統(tǒng)分類鑒定。

1.4 脫色效果測(cè)定

從脫色培養(yǎng)液中取出5mL樣液，以6000r／min的轉(zhuǎn)速離心15min，緩緩傾倒出上清液，以未加染料的液體培養(yǎng)基為參比，測(cè)量上清液在染料最大吸收波長(zhǎng)（λ＝616nm）處吸光度值，計(jì)算染料去除率［11］。

染料去除率＝（A0－Ae）／A0×100%，其中，A0為未接種微生物的空白對(duì)照樣品的染料溶液吸光度；Ae為離心去除菌體后的上清液中殘留染料的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色菌的分離鑒定

用富集培養(yǎng)基進(jìn)行5代的馴化培養(yǎng)，然后在固體培養(yǎng)基上經(jīng)過多次劃線分離，得到對(duì)孔雀石綠染料有脫色能力的菌株。將菌株接種于LB培養(yǎng)基、30℃恒溫培養(yǎng)24h活化，活化后細(xì)菌懸液調(diào)整至吸光度A600＝0.6±0.05，取5mL菌液，將其加入50mL含60mg／L孔雀石綠染料的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃的恒溫培養(yǎng)箱里靜置培養(yǎng)，測(cè)定其脫色能力。

不同菌株對(duì)孔雀石綠染料的脫色率如圖1所示，可以看出菌株 MG－2、MG－6和 MG－7對(duì)孔雀石綠脫色非常明顯，脫色率均在94%以上。

3株菌對(duì)孔雀石綠染料的脫色過程如圖2所示。結(jié)果表明，經(jīng)過64h脫色，3株菌對(duì)孔雀石綠脫色非常明顯，脫色率在94%以上，而菌株MG－2和菌株MG－7在24h內(nèi)對(duì)孔雀石綠的脫色率超過82%，36h的去除率超過94%。菌株MG－6在36h內(nèi)對(duì)孔雀石綠的脫色效率也能達(dá)到80%，48h的去除率達(dá)到91.71%。

圖1 不同菌株對(duì)孔雀石綠的脫色率

圖2 單菌株對(duì)孔雀石綠染料的脫色過程

觀察菌株 MG－2、MG－6和 MG－7在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，其結(jié)果見表1所列。將各菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送交測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序，獲得各菌株分別從8F和1492R兩端的測(cè)序結(jié)果，使用DNAStar軟件包中的SeqMan軟件將兩側(cè)序列進(jìn)行拼接，并舍去兩端可信度不高的片段，將可信度較高的片段（約1300bp）提交至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定這3株菌的菌屬，結(jié)果見表2所列。

表1 菌株形態(tài)觀察結(jié)果

表2 16SrDNA基因測(cè)序結(jié)果（相似率均在98%以上）

2.2 菌株脫色性能研究

工業(yè)實(shí)際廢水成分復(fù)雜，治理過程中存在許多限制因素，研究選用最顯著的影響因子pH值、鹽度、溫度及氧氣，觀察染料孔雀石綠脫色率。

2.2.1 pH值對(duì)菌株脫色的影響

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)環(huán)境pH 值為5、6、7、8、9下，3株菌對(duì)60mg／L染料孔雀石綠的脫色效果。首先，配置無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基分裝50mL三角瓶，滅菌后用5mol／L鹽酸和2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8、9。活化培養(yǎng)3株菌24h，以10%接種量接種于滅菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)，從12h起每6h取樣測(cè)定離心后上清液在616nm處吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，3株單菌在中性條件下脫色效果最好，在偏堿性（pH＞7）條件下具有較高的脫色率，在偏酸性（pH≤6）條件下脫色率較低。菌株MG－7對(duì)pH值的適應(yīng)范圍較廣，但其脫色過程存在較為明顯的停滯現(xiàn)象，0～24h的脫色效果均不明顯，24h后脫色效果明顯上升。菌株MG－6和MG－2在處理孔雀石綠染料時(shí)停滯期相對(duì)較短，pH值在5～6時(shí)，基本無(wú)脫色效果；在pH＝7時(shí)，24h染料的脫色率達(dá)到95%；pH值在8～9時(shí)，菌株MG－2初始脫色率較高，但48h后，菌株 MG－6的脫色率高于菌株 MG－2，pH＝8時(shí)菌株MG－6的脫色率達(dá)到89.5%。

圖3 pH值對(duì)脫色率的影響

2.2.2 溫度對(duì)菌株脫色的影響

不同的環(huán)境溫度影響菌體酶的活性而影響菌株對(duì)染料的脫色效果。本研究考察菌株在10、20、30、37、45、55℃條件下對(duì)60mg／L染料孔雀石綠的脫色效果的影響?；罨囵B(yǎng)3株菌24h，以10%接種量接種于含60mg／L孔雀石綠的滅菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別置于實(shí)驗(yàn)所需溫度的恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，從12h起每6h取樣測(cè)定離心后上清液在616nm處吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

從圖4可以看出，溫度對(duì)菌株對(duì)染料孔雀石綠的脫色有明顯的影響，在低溫條件下（θ≤10℃）3，株菌對(duì)孔雀石綠均無(wú)明顯脫色作用，隨著溫度升高，3株菌對(duì)孔雀石綠的脫色率先增大后減小，3株菌的最適脫色溫度均為30℃。菌株MG－2和菌株 MG－6對(duì)溫度的適應(yīng)能力較好，在20～37℃范圍內(nèi)都有較高的脫色效率，菌株MG－2的脫色要快于菌株MG－6；菌株MG－7對(duì)溫度的適應(yīng)能力相對(duì)較差，只在溫度為30℃時(shí)具有較高的脫色效率，在溫度較低或較高時(shí)脫色效率都較差，其脫色過程中存在一個(gè)明顯的停滯期（0～24h），24h后細(xì)菌將染料迅速降解。

圖4 溫度對(duì)脫色率的影響

2.2.3 氧氣條件對(duì)菌株脫色的影響

本研究考察菌株在好氧、厭氧及兼氧條件下對(duì)60mg／L染料孔雀石綠的脫色效果的影響。活化培養(yǎng)3株菌24h，以10%接種量接種于滅菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，提供不同氧氣條件，于30℃恒溫靜置培養(yǎng)48h，從12h起每6h取樣測(cè)定離心后上清液在616nm處吸光度值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 氧氣對(duì)脫色率的影響

從圖5可見，3株菌在好氧條件下對(duì)孔雀石綠的脫色率均較低，在厭氧和兼氧條件下的脫色率明顯高于好氧條件。菌株MG－6在3種氧氣條件下都有較高的脫色率，在厭氧和兼氧條件下的脫色過程相似，脫色效率超過95%，在好氧條件的脫色率也超過70%；菌株MG－2在厭氧和兼氧條件的脫色過程基本相同，脫色效率都超過96%，而在好氧條件下脫色率只有51%；菌株MG－7最適宜在兼氧條件下對(duì)孔雀石綠進(jìn)行脫色降解，在厭氧條件下的脫色效果明顯下降，在好氧條件下基本無(wú)脫色。同時(shí)，還可以發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)染料的脫色速率存在差異：菌株 MG－2＞菌株MG－6＞菌株 MG－7。菌株 MG－2經(jīng)活化后能立即對(duì)孔雀石綠進(jìn)行降解脫色，而菌株MG－7經(jīng)活化后接種到染料廢水中，需要24h的停滯期才開始對(duì)染料進(jìn)行降解脫色，菌株MG－6的停滯期介于兩者之間。

2.2.4 鹽度對(duì)菌株脫色的影響

鹽度對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和污染物的降解有著重要影響，耐鹽菌具有特殊結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)，在高鹽污染料廢水的處理方面發(fā)揮著重要作用。以NaCl作為鹽度表征，考察NaCl質(zhì)量濃度為5、10、20、30、40、50g／L的條件下，對(duì)60mg／L孔雀石綠染料的脫色效果?；罨囵B(yǎng)3株菌24h，以10%接種量接種于滅菌無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)48h，從12h起每6h取樣測(cè)定離心后上清液在616nm處吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

從圖6中可以看出，菌株MG－7具有較好的耐鹽性，菌株 MG－2和菌株 MG－6對(duì)鹽度的適應(yīng)性比菌株 MG－7差，隨著ρ（NaCL）的增加，菌株對(duì)染料的脫色率出現(xiàn)一定程度的下降。ρ（NaCL）在10g／L以下時(shí)，鹽度對(duì)菌株MG－2的脫色效果基本無(wú)影響，12h的脫色率已達(dá)到53.6%，18h后基本保持在90%以上的脫色率；ρ（NaCL）在30g／L以下時(shí)，鹽度對(duì)菌株 MG－2脫色有一定程度的影響，起始脫色率降低，經(jīng)過48h的處理最終脫色率趨于平穩(wěn)，為82.4%；ρ（NaCL）在40～50g／L時(shí)，鹽度對(duì)菌株MG－2脫色有明顯的抑制作用，初始基本無(wú)脫色作用，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，最高脫色率為56.4%。ρ（NaCL）在10g／L以下時(shí)，菌株MG－6對(duì)染料的脫色延遲于菌株MG－2，30h后對(duì)孔雀石綠的脫色率也在90%以上；ρ（NaCL）在30g／L以下時(shí)，鹽度對(duì)菌株 MG－6脫色的影響基本上與菌株 MG－2類似；ρ（NaCL）為40g／L時(shí)，雖然脫色比較緩慢，但保持上升態(tài)勢(shì)；ρ（NaCL）為50g／L時(shí)，菌株 MG－6對(duì)孔雀石綠的脫色有較明顯的抑制作用，起始脫色速率較快，但24h后脫色率穩(wěn)定在50%左右。ρ（NaCL）為5～50g／L時(shí)，鹽度對(duì)菌株MG－7的脫色沒有明顯影響，初始脫色率有一定差異，但30h后脫色率都保持在90%以上。上述結(jié)果說(shuō)明3株菌都有一定的耐鹽能力，其中菌株MG－7對(duì)鹽度的適應(yīng)性最強(qiáng)。根據(jù)文獻(xiàn)［16］對(duì)耐鹽菌的劃分，3株菌都屬于耐鹽菌類型，這對(duì)實(shí)際污染廢水處理有重要意義。

圖6 鹽度對(duì)脫色率的影響

2.3 脫色降解酶初步分析

將3株菌接種于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待48h完全脫色后，進(jìn)行3組實(shí)驗(yàn)。第1組實(shí)驗(yàn)為取20mL含孔雀石綠無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基直接加入此培養(yǎng)液20mL；第2組實(shí)驗(yàn)為將此培養(yǎng)液離心，取上清液20mL，加入等體積含孔雀石綠無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基；第3組實(shí)驗(yàn)為將離心后沉淀的菌體用不含孔雀石綠的pH＝7磷酸緩沖液洗3次，再加入20 mL含孔雀石綠無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基以及20mL不含孔雀石綠無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基。3組實(shí)驗(yàn)均在30℃條件下，重復(fù)3次，其脫色率見表3所列。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在第1組和第2組實(shí)驗(yàn)中，菌株對(duì)于孔雀石綠染料的脫色綠均超過90%，第3組實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)染料無(wú)脫色。這說(shuō)明孔雀石綠降解酶主要存在于培養(yǎng)液中，屬于胞外酶。

表3 菌體或上清液對(duì)脫色率的影響 %

3 結(jié) 論

（1）通過馴化培養(yǎng)和多次劃線分離，得到對(duì)孔雀石綠染料有高效脫色能力的菌株，16SrDNA基因序列比對(duì)結(jié)果表明3株高效脫色菌分屬En－terobacter asburiae（MG－2）、Escherichia coli（MG－6）和Enterobacter ludwigii（MG－7）。3株菌都能有效降解孔雀石綠染料，48h對(duì)60mg／L孔雀石綠的脫色率達(dá)到97%。

（2）3株菌對(duì)孔雀石綠的最適脫色條件為：pH＝7.0，溫度為30℃，兼性厭氧，且對(duì)鹽度都有一定的耐適性，屬于耐鹽菌。

（3）在脫色過程中，菌株 MG－2基本不出現(xiàn)停滯期，菌株 MG－7存在24h的停滯期，菌株MG－6的停滯期時(shí)間介于兩者之間。

（4）通過對(duì)孔雀石綠染料降解過程的研究，發(fā)現(xiàn)孔雀石綠降解酶主要存在于培養(yǎng)液中，屬于胞外酶。

［1］徐成勇，郭 波，周 蓮，等.白腐菌對(duì)染料脫色和降解作用的研究進(jìn)展［J］.生物工程進(jìn)展，2002，22（01）：57－60.

［2］李慧蓉，陳 武，陳和謙.黃孢原毛平革菌對(duì)三苯甲烷染料的生物脫色降解［J］.上海環(huán)境科學(xué)，2003，22（11）：738－742，749.

［3］仇國(guó)蘇，張旭東，陳仕功.認(rèn)識(shí)孔雀石綠［J］.化學(xué)教育，2007（5）：2，23.

［4］徐淑霞，馮航標(biāo)，張世敏，等.黃孢原毛平革菌對(duì)孔雀石綠生物脫色條件的研究［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，43（4）：437－440.

［5］成 文，曾寶強(qiáng).孔雀綠染料的微生物脫色研究［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2000，6（4）：370－373.

［6］董新姣，謝榮敏.固定化青霉X5對(duì)孔雀石綠的脫色研究［J］.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2006，7（1）：45－49.

［7］李 怡，何 珊，曹海鵬，等.孔雀石綠脫色菌惡臭假單胞菌菌株M6的分離、鑒定及其生長(zhǎng)特性研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（1）：57－63.

［8］任 倩，蔣麗娟，宋 煒，等.孔雀石綠降解菌M3的分離鑒定及降解特性研究［J］.生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2007，23（3）：65－69.

［9］林少芳，余 萍，林玉滿.一株綠膿假單胞菌對(duì)堿性孔雀綠脫色的初步研究［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，20（4）：72－75.

［10］Holt J G，Krineg N R，Sneath P H A.Bergey’s manual of determinative bacteriology［M］.9th ed.Baltimore，Maryland：Williams ＆Wilkins，1994：385－452.

［11］周元祥，石倩倩，葉紅曼.高效溴氨酸脫色菌的分離鑒定及其特性研究［J］.合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，33（7）：1057－1061.

［12］Nakanishi M，Yatome C，Ishida N.Putative ACP phosphodiesterase gene（acpD）encodes an azoreductase［J］.The Journal of Biological Chemistry，2001，276（49）：46394－46399.

［13］Tripura C，Reddy P S，Reddy M K，et al.Glucose dehydrogenase of a rhizobacterial strain of Enterobacter asburiae involved in mineral phosphate solubilization shares properties and sequence homology with other members of enterobacteriaceae ［J］.Indian Journal of Microbiology，2007，47（2）：126－131.

［14］Kavita B，Shukla S，Kumar G N，et al.Amelioration of phytotoxic effects of Cd on mung bean seedlings by gluconic acid secreting rhizobacterium Enterobacter asburiae PSI3and implication of role of organic acid［J］.World J Microbiol Biotechnol，2008，24（12）：2965－2972.

［15］Park H，Sanchez D，Cho S K.Bacterial communities on electron－ream Pt－deposited electrodes in a mediator－less microbial fuel cell［J］.Environmental Science ＆ Technology，2008，42（16）：6243－6249.

［16］Kushner D J.Life in high salt and solute concentrations：halophilic bacteria［M］／／Microbial Life in Extreme Environments.London：Academic Press，Ltd，1978：317－368.