應(yīng)用Taqman－MGB探針法檢測(cè)地中海貧血Hb Westmead突變＊

陳文強(qiáng)，陳 萍，龐麗紅，李樹全，林偉雄，楊德寨

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，南寧530021）

地中海貧血（以下簡(jiǎn)稱地貧）是一種常染色體遺傳慢性溶血性疾病，該病多見于我國(guó)廣東，廣西等地區(qū)。根據(jù)基因突變的不同，主要分為α地貧和β地貧兩大類。Hb Westmead突變屬于非缺失型地貧中的一種，可產(chǎn)生輕度不穩(wěn)定的血紅蛋白變異體［1］。單純的Hb Westmead突變攜帶者沒有貧血的臨床表現(xiàn)，但是與攜帶有輕型地貧患者婚育，則有可能生下中間型α地貧患兒。為了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速地診斷該病，本文應(yīng)用Taqman－MGB探針技術(shù)，建立了Hb Westmead突變熒光探針檢測(cè)方法，檢測(cè)過程操作簡(jiǎn)單、快速，檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、特異性高。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部病例來自在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診就診的患者，選擇平均紅細(xì)胞體積在70～80fl之間的患者共200例，其中，男96例，女104例。

1.2 方法

1.2.1 血液學(xué)分析 用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀（ACT5DF，美國(guó)Beckman）進(jìn)行檢測(cè)，收集平均紅細(xì)胞體積（MCV）等數(shù)據(jù)。

1.2.2 DNA提取 自動(dòng)核酸提取儀（Lab－Aid 820，廈門百維信）提取DNA，微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop ND－8000，美國(guó)Thermo）檢測(cè)DNA濃度。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)正向擴(kuò)增引物：W1：GCG CAG GAG GAA CGG CTA和反向擴(kuò)增引物 W2：CGG CAC TGA CCC TCT TCT CT，擴(kuò)增目標(biāo)片段；合成兩條MGB探針M1：FAM－CAG GGA GGC GTG CA，M2：VIC－CAG GGA GGC CTG CA；檢測(cè)含α2珠蛋白基因CD122（CAC→CAG）突變，引物和探針由美國(guó)ABI公司合成。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增體系總體積為25μL：其中 Master mix 12.5μL，20×Taqman genotype assay 1.25 μL，DNA模板1.0μL，加雙蒸水至25μL。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10min→ （95℃10s，60℃60s）共40個(gè)循環(huán)；在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（7500Fast，美國(guó)ABI）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析，判定結(jié)果。

1.2.5 DNA 測(cè)序 設(shè)計(jì)上游引物：L1：5′－CCT GGG CCG CAC TGA CCC TCT T－3′。下游引物 L2：5′－GTC TGA GAC AGG TAA ACA CCT CCA T－3，擴(kuò)增含目標(biāo)基因第122位密碼子的α2珠蛋白基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為340bp。反應(yīng)體系包括：10×Buffer 5μL，2.5mMol／L d NTPs 4μL，15 pmol／L引物1μL，1.0UTaq酶（大連寶生物），模板2.0μL，加雙蒸水至50μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃30s，退火、延伸64℃90s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)純化后使用BigDyeTM Terminator v3.1Ready Reaction Cycle Sequencing試劑盒在全自動(dòng)測(cè)序儀（PRISM3730，美國(guó)ABI）上進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0軟件，利用Kappa分析比較兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。

2 結(jié) 果

2.1 血常規(guī)情況 200例患者的RBC水平為（4.92±0.65）×1012／L，HB水平為（122.66±17.89）g／L，MCV 水平為（76.04±2.93）fl，MCH 水平為（24.91±1.42）pg。

2.2 Taqman－MGB探針法檢測(cè)Hb Westmead突變結(jié)果 在檢測(cè)200例患者中，發(fā)現(xiàn)Hb Westmead突變12例，其中，男5例，女7例，其余188例患者檢測(cè)結(jié)果為正常。在健康人標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果可見三條反應(yīng)曲線，而Hb Westmead突變基因攜帶者標(biāo)本的擴(kuò)增曲線可見四條曲線，健康人和攜帶者擴(kuò)增曲線的位置，形態(tài)有區(qū)別明顯。

2.3 基因測(cè)序法檢測(cè)Hb Westmead突變結(jié)果 基因測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果見圖1，在200例患者中，其余188例患者檢測(cè)結(jié)果為正常，結(jié)果見圖1A，檢測(cè)出Hb Westmead突變12例，其中，男5例，女7例，結(jié)果見圖1B。

圖1 地貧Hb Westmead突變DNA測(cè)序結(jié)果

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果 經(jīng)Kappa分析，Kappa＝1，P＜0.01，兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果一致，即對(duì)所研究對(duì)象同時(shí)用Taqman－MGB探針法和基因測(cè)序法檢測(cè)Hb Westmead突變發(fā)生率，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明兩種檢測(cè)方法對(duì)Hb Westmead突變的檢出率沒有差別。

3 討 論

Hb Westmead是一種非缺失型α地貧，是α2－珠蛋白基因CD122（CAC→CAG）突變所致的靜止性血紅蛋白變異體，具有輕度不穩(wěn)定性。Hb Westmead突變基因攜帶者，臨床上沒有貧血、黃疸等表現(xiàn)，血常規(guī)檢測(cè)可以是正?；蛑挥休p微改變，如血色素、MCV、MCH等指標(biāo)輕微降低，比較容易出現(xiàn)漏診。Hb Westmead突變基因攜帶者可在感染、發(fā)熱或使用磺胺等氧化性藥物的情況下出現(xiàn)溶血，導(dǎo)致輕微的貧血［2］。本文中所發(fā)現(xiàn)的12例患者，均沒有貧血表現(xiàn)，而是在例行婚前，孕期體檢中發(fā)現(xiàn)MCV輕微降低，進(jìn)一步做基因診斷而發(fā)現(xiàn)。

由于Hb Westmead是一種電泳靜止型的血紅蛋白變異體，因此各種酸性或堿性醋酸纖維膜電泳、垂直等電聚焦法均不能使之分離；高效液相色譜法進(jìn)行血紅蛋白分析時(shí)也沒有特異性波峰出現(xiàn)。針對(duì)該異常血紅蛋白的特異性檢測(cè)方法是Fleming等使用的pH 6.4柱層析電泳法，他用這個(gè)方法從血紅蛋白中分離并發(fā)現(xiàn)了Hb Westmead［1］，另外，對(duì)該血紅蛋白的測(cè)定使用毛細(xì)管電泳法［3］，反相高效液相色譜法等方法［4］。對(duì)Hb Westmead的CD122（CAC→CAG）突變的基因診斷則使用PCR聯(lián)合StuI內(nèi)切酶法［5］，溫度梯度凝膠電泳法［6］和反向斑點(diǎn)雜交等方法檢測(cè)該突變點(diǎn)，但這些方法操作步驟多，檢測(cè)周期長(zhǎng)。本研究采用Taqman－MGB探針法直接探測(cè)PCR過程中熒光信號(hào)的變化，以獲得定性的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測(cè)，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，可在短時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果。本文200例標(biāo)本用Taqman－MGB探針法檢測(cè)，結(jié)果和基因測(cè)序的結(jié)果一致，說明該方法具有較高的可靠性。同時(shí)該方法所設(shè)計(jì)的MGB探針結(jié)合在DNA雙螺旋內(nèi)，使探針的結(jié)合穩(wěn)定；其次MGB探針的較短，報(bào)告基團(tuán)與淬滅分子在位置上很接近，這樣使得實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有較高的精確度；另外探針3C端結(jié)合了MGB，探針的Tm值提高，使突變與非突變模板間的Tm值差異增加，提高了檢測(cè)的特異性。綜上所述，Taqman－MGB探針法可以快速檢測(cè)Hb Westmead突變，結(jié)果穩(wěn)定可靠，特異性高。

Hb Westmead在澳大利亞［1］、巴西［7］、老撾［8］及國(guó)內(nèi)香港地區(qū)［9］均有個(gè)例報(bào)道，但病例報(bào)道數(shù)量不多。在廣西也有相關(guān)報(bào)道［10－11］，在本文中，檢測(cè)的200紅細(xì)胞體積輕微異常患者共發(fā)現(xiàn)12例Hb Westmead突變，發(fā)生率為6%，說明Hb Westmead突變?cè)趶V西有著比較高的基因攜帶率。在這12例患者中，均無明顯貧血癥狀，但當(dāng)Hb Westmead復(fù)合東南亞α地貧時(shí)（HbH??；－－SEA／αWSα）可出現(xiàn)脾臟增大，輕度貧血等臨床癥狀［12］。因此，在產(chǎn)前優(yōu)生遺傳咨詢時(shí)，對(duì)于一方已診斷輕型或中間型α地貧，另一方?jīng)]有貧血癥狀、但血常規(guī)有 MCV輕微降低的夫婦，注意需要進(jìn)一步做Hb Westmead突變的基因分析，以免漏診，生下 HbH ?。ǎ璖EA／αWSα）的患兒。

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