當(dāng)歸多糖對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護(hù)作用的研究＊

何曉莉，張 雁，吳 宏，姜 蓉

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室／干細(xì)胞與組織工程研究室 400016）

當(dāng)歸多糖對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)保護(hù)作用的研究＊

何曉莉，張 雁，吳 宏△，姜 蓉

（重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室／干細(xì)胞與組織工程研究室 400016）

目的研究當(dāng)歸多糖（APS）對(duì)電離輻射引起小鼠骨髓損傷的影響，旨在闡明APS對(duì)輻射性造血損傷的保護(hù)作用。方法采用直線加速器一次性4.0Gy劑量全身均勻照射C57BL／6小鼠，建立小鼠放射損傷動(dòng)物模型。取外周血并進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMNC）并計(jì)數(shù)；骨髓切片染色觀察骨髓造血細(xì)胞數(shù)量改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡率；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)p53的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，生理鹽水（NS）組外周血白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）及BMNC計(jì)數(shù)均明顯減少，骨髓腔內(nèi)造血組織顯著減少，BMNC G0／G1期比例、凋亡率、p53表達(dá)均升高；2mg／kg APS組和8mg／kg APS組均能提高外周血WBC、RBC、PLT及BMNC計(jì)數(shù)，增加骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞數(shù)量，降低G0／G1期細(xì)胞比例以及細(xì)胞凋亡率。結(jié)論APS可以促進(jìn)骨髓造血系統(tǒng)恢復(fù)，對(duì)輻射損傷具有良好的保護(hù)作用。

輻射損傷；造血系統(tǒng)；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡；當(dāng)歸多糖

當(dāng)歸被廣泛應(yīng)用在中藥的復(fù)方和驗(yàn)方中，當(dāng)歸多糖（angelica polysaccharides，APS）是當(dāng)歸的主要生物活性物質(zhì)［1］，近年來(lái)對(duì)APS成分和藥理學(xué)研究有了新的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)有明顯作用以及抗腫瘤、抗放射性損傷的良好療效［2］。本文主要探討APS在造血系統(tǒng)抗輻射損傷方面的作用，旨在為其作為輻射保護(hù)劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 采用健康清潔級(jí)C57BL／6小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》的標(biāo)準(zhǔn)。主要試劑與設(shè)備，APS（產(chǎn)地：甘肅岷縣）由重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室分離、提純（純度大于950mg／g）。人淋巴細(xì)胞分離液（TBD公司）。蘇木素－伊紅（HE）染色試劑盒，Annexin V－FITC／PI檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；抗小鼠P53抗體（碧云天生物技術(shù)研究所進(jìn)口分裝）。免疫染色試劑盒、DAB顯色試劑（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）。超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀。

1.2 方法

1.2.1 分組處理 小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組（注射生理鹽水，共18只）；生理鹽水（NS）組、2mg／kg APS組和8mg／kg APS組（后3組各54只），共計(jì)180只。后3組小鼠采用直線加速器全身均勻照射，總劑量4.0Gy［3］，時(shí)間1.25min，X射線吸收劑量率為3.76Gy／min，焦點(diǎn)距小鼠100cm，面積25cm×25cm［4］。照射后約3h內(nèi)腹腔分別注射 NS、2mg／kg APS和8mg／kg APS，每天0.2毫升／次，連續(xù)注射7d后眼眶取血并處死小鼠，取其骨髓［5］。

1.2.2 外周血檢測(cè)指標(biāo)計(jì)數(shù) 常規(guī)方法進(jìn)行白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)并取出骨髓。采用Ficoll－Hypague密度梯度離心法（密度：1.077±0.002），2 000r／min離心20min后獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞（bone marrow mononuclearcell，BMNC），制成懸液，按 WBC計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)。

表1 4組小鼠外周血細(xì)胞和BMNC的比較（±s，n＝6）

表1 4組小鼠外周血細(xì)胞和BMNC的比較（±s，n＝6）

★：P＜0.05，與對(duì)照組比較；▲：P＜0.05，與NS組比較。

組別 WBC（×109／L） RBC（×1012／L） PLT（×109／L） BMNC（×106／股骨）對(duì)照組 7.05±0.87 10.84±1.67 1 203.33±256.62 3.69±0.75 NS組 1.54±0.13★ 7.47±0.32★ 287.76±79.65★ 0.86±0.19★2mg／kg APS組 1.87±0.19★ 8.68±0.61★▲ 318.08±96.01★ 1.91±0.13★▲8mg／kg APS組 3.41±0.07★▲ 9.59±0.43★▲ 623.08±187.91★▲ 2.75±0.17★▲

1.2.3 觀察放射后小鼠骨髓的病理學(xué)改變 采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出一側(cè)股骨，經(jīng)取材、固定、洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、脫蠟復(fù)水、HE染色、封片后，顯微鏡下觀察骨髓病理學(xué)改變［6］。

1.2.4 BMNC細(xì)胞周期的測(cè)定 收集BMNC，70%冰乙醇4℃固定過(guò)夜；經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，再加入100μL牛胰核糖核酸酶（1mg／mL）；37℃水浴箱中孵育30min，加入碘化丙啶染色液（50μg／mL），避光反應(yīng)30min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Multicycle軟件（日本Phenix公司）分析。

1.2.5 BMNC凋亡率的檢測(cè) 收集BMNC，PBS洗滌細(xì)胞2次，用1×binding緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106／mL；取100μL樣品，再加入5μL Annexin V－FITC和5μL碘化丙啶（PI）；混勻細(xì)胞，25℃暗室孵育15min；每份樣品加入1×binding緩沖液100μL后流式細(xì)胞儀檢測(cè)；利用FCM雙參數(shù)分析區(qū)分出凋亡細(xì)胞并計(jì)算凋亡率。

1.2.6 BMNC p53蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) 收集BMNC，制成細(xì)胞懸液。4%多聚甲醛固定15min，PBS沖洗3次每次5min；按免疫染色及DAB顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色、顯色，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察，p53陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕褐色，陰性細(xì)胞不著色。隨機(jī)選擇5個(gè)視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算p53陽(yáng)性率＝p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／100×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 APS對(duì)放射損傷小鼠外周血的影響 照射后第7天NS組與對(duì)照組相比，全血各系及BMNC計(jì)數(shù)全面下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2mg／kg APS組小鼠外周血 WBC、RBC和PLT及BMNC與NS組相比，各項(xiàng)指標(biāo)均有所升高，僅RBC和BMNC計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；8mg／kg APS組與NS組相比，升高更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；外周血各項(xiàng)指標(biāo)及BMNC計(jì)數(shù)至第7天仍低于正常水平，見(jiàn)表1。

2.2 APS對(duì)放射損傷小鼠骨髓的影響 照射后第7天NS組與對(duì)照組相比，骨髓腔內(nèi)造血組織顯著減少；而2mg／kg APS組與NS組相比，造血組織有所增加；8mg／kg APS組與NS組相比，造血組織明顯增加；2mg／kg APS組與8mg／kg APS組相比，后者骨髓腔內(nèi)造血組織多于前者，但至照射后第7天，各照射組骨髓造血面積仍未恢復(fù)至正常水平，見(jiàn)圖1。

2.3 APS對(duì)放射損傷小鼠BMNC細(xì)胞周期的影響 照射后第7天NS組BMNC停滯于G0／G1期，與對(duì)照組比較顯著均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨時(shí)間變化，G0／G1期細(xì)胞比例呈由高到低的變化，到第7天時(shí)仍未恢復(fù)正常。2mg／kg APS組和8mg／kg APS組與NS組比較，其G0／G1期比例均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 4組小鼠BMNC細(xì)胞周期、凋亡率以及p53表達(dá)陽(yáng)性率的比較（±s，n＝6）

表2 4組小鼠BMNC細(xì)胞周期、凋亡率以及p53表達(dá)陽(yáng)性率的比較（±s，n＝6）

★：P＜0.05，與對(duì)照組比較；▲：P＜0.05，與NS組比較。

組別 G0／G1期（%） 凋亡率（%） p53表達(dá)陽(yáng)性率（%對(duì)照組）55.82±2.84 5.53±1.85 0.00 NS組 75.23±10.69★ 12.37±1.26★ 23.39±4.34★2mg／kg APS組 63.17±6.01★▲ 7.25±0.93★▲ 22.45±4.27★8mg／kg APS組 64.65±4.17★▲ 6.24±0.79★▲ 22.57±1.97★

2.4 APS對(duì)放射損傷小鼠BMNC凋亡率的影響 照射后第7天NS組BMNC的凋亡率均較正常組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2mg／kg APS組和8mg／kg APS組與 NS組相比，凋亡率均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但仍高于對(duì)照組水平，見(jiàn)表2。

2.5 APS對(duì)放射損傷小鼠BMNC p53表達(dá)陽(yáng)性率的影響對(duì)照組小鼠BMNC不表達(dá)p53，NS組、2mg／kg APS組和8 mg／kg APS組均有表達(dá)，且與對(duì)照組相比，p53的表達(dá)率升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2，封4圖2。

3 討 論

骨髓是機(jī)體對(duì)電離輻射高度敏感器官之一，也是機(jī)體的主要造血器官。電離輻射對(duì)造血系統(tǒng)的損傷主要表現(xiàn)為造血功能的破壞和抑制，而造血功能障礙主要表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少［7］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NS組 WBC、RBC、PLT及BMNC計(jì)數(shù)顯著降低。HE染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NS組骨髓腔內(nèi)造血組織面積明顯減小，造血細(xì)胞數(shù)量減少。

APS有明顯的抗輻射作用，主要表現(xiàn)在促進(jìn)機(jī)體造血功能恢復(fù)，增加血細(xì)胞含量［8－11］。本研究結(jié)果還顯示，與NS組相比，兩種劑量APS組WBC、RBC、PLT及BMNC計(jì)數(shù)均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，兩種劑量APS組骨髓腔內(nèi)的造血組織面積均明顯增大，造血細(xì)胞數(shù)量增多。證明APS可促進(jìn)電離輻射引起的造血系統(tǒng)損傷的恢復(fù)，與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

國(guó)內(nèi)外大量研究表明，電離輻射不僅可以加速細(xì)胞衰老，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］。p53基因既參與細(xì)胞周期停滯，還與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［13］。野生型p53基因半衰期短，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)不到其表達(dá)，故本研究檢測(cè)突變型p53基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，p53基因在對(duì)照組不表達(dá)，照射組表達(dá)率顯著升高，但各APS組和NS組比較差異不明顯，這可能是由于突變型p53基因的表達(dá)不會(huì)因?yàn)閾p傷得到修復(fù)而減少所致。細(xì)胞周期和凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，NS組與對(duì)照組相比，G0／G1期比例和凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各APS組與NS組比較，G0／G1期比例和凋亡率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明電離輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，APS可以促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯及凋亡的恢復(fù)。

目前，放療是腫瘤的主要治療方式，它在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷機(jī)體正常細(xì)胞，因此，輻射保護(hù)劑的開(kāi)發(fā)勢(shì)在必行。大量文獻(xiàn)報(bào)道APS有明顯的抗輻射、抗腫瘤等作用，但其具體機(jī)制仍不清楚，本研究就APS抗電離輻射的機(jī)制進(jìn)行基礎(chǔ)研究，為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。

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Studys of angelica polysaccharides on the protection of ionizing radiation in injured mice＊

He Xiaoli，Zhang Yan，Wu Hong△，Jiang Rong
（Department of Histology and Embryology，Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering，F(xiàn)aculty of Basic Medical Sciences，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China）

ObjectiveTo study the effects of angelica polysaccharide（APS）on the damage of bone marrow by ionizing radiation in injured mice，so as to illuminate the protective effects of APS against radioactive haematogenesis injury.MethodsUsing the linear accelerator irradiate C57BL／6mice one time with 4.0Gy X ray to establish the animal radiation injured model.Then these mice were killed and extracted BMNC after 7days injection.Counting the number of the blood cells and BMNCs and observing the pathology change of bone marrow.The cell cycle and apoptosis rate were detected by flow cytometry and the expression of p53was detected by immunocytochemistry.ResultsCompared with normal group，the percentage of G0／G1phase，apoptosis rate and the expression of p53increased significantly，while the number of the blood cells and BMNCs，the number of cells in bone marrow obviously decreased in NS group；both in the 2mg／kg APS and 8mg／kg APS group，the percentage of G0／G1phase and apoptosis rate decreased，while t he number of the blood cells and BMNCs，the number of cells in bone marrow increased.ConclusionAPS can improve the fuction of bone marrow hematopoietic system and have protection in ionizing radiation.

radiation injuries；hematopoietic system；cell cycles；apoptosis；angelica polysaccharide

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.019

A

1671－8348（2012）35－3734－03

重慶市渝中區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（20110321）。 △

，Tel：13368080808；E－mail：wuhong6368＠126.com。

2012－06－13

2012－09－12）

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