Cyclin E、p53與PTEN在胃癌組織中的表達及臨床意義

謝智惠，王 蕾，陳 進，金琳芳

（蘇州大學附屬第四醫(yī)院：1.普外科；2.外科；3.病理科，江蘇無錫214062）

Cyclin E、p53與PTEN在胃癌組織中的表達及臨床意義

謝智惠1，王 蕾2，陳 進1，金琳芳3

（蘇州大學附屬第四醫(yī)院：1.普外科；2.外科；3.病理科，江蘇無錫214062）

目的研究細胞周期蛋白E（Cyclin E）、p53、第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（PTEN）在胃癌組織中的表達及意義。方法采用免疫組化法檢測65例胃癌和13例胃正常黏膜石蠟標本中Cyclin E、p53及PTEN的表達情況。結(jié)果（1）Cyclin E在胃癌組織中高表達，并隨腫瘤浸潤深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、臨床分期的提高、腫瘤分化程度的降低及出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移而升高（P＜0.05）。（2）p53在胃癌組織中的高表達，并隨腫瘤浸潤深度的加深、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、臨床分期的提高、腫瘤分化程度的降低及出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移而升高（P＜0.05）。（3）PTEN在胃癌組織中低表達，并隨腫瘤浸潤深度的加深、分化程度的降低、淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生及臨床分期的增高及出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移而降低（P＜0.05）。（4）PTEN的表達與Cyclin E和p53的表達呈負相關(guān)，Cyclin E和p53表達呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論Cyclin E、p53、PTEN在胃癌的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中存在相互抑制作用；他們均可以作為胃癌生物學行為和預(yù)后判斷的獨立指標，但三者聯(lián)合檢測準確性可能更高。

胃腫瘤；細胞周期蛋白E；p53；磷酸酶和張力蛋白同源物基因；生物學行為

胃癌在全世界范圍內(nèi)是發(fā)病率最高的癌癥之一，中國是胃癌的高發(fā)區(qū)，目前胃癌的病因?qū)W、發(fā)病機制以及浸潤和轉(zhuǎn)移的機制仍未完全明了。本研究采用免疫組化法對65例胃癌和13例正常胃黏膜組織中的人類細胞周期蛋白E（Cyclin E）、p53與人類第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tension homology detected on chromosome ten，PTEN）的表達情況分別進行檢測，分析他們的表達與患者性別、年齡、大小、浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等參數(shù)的關(guān)系，從而為進一步闡明胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子調(diào)控機制，為判斷胃癌的預(yù)后及分子靶向治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008年1月至2010年12月，本院病理科石蠟包埋組織標本78例，其中胃癌65例，正常胃黏膜13例。65例胃癌患者中，男39例，女26例；年齡36～75歲，平均58.6歲。病理類型：高分化腺癌17例，中、低分化腺癌、印戒及黏液細胞癌48例。無淋巴轉(zhuǎn)移者35例，有淋巴轉(zhuǎn)移者30例。TNM分期：Ⅰ期及Ⅱ期共20例，Ⅲ期及Ⅳ期共45例。所有患者在術(shù)前均未接受放療和化療處理。

1.2 儀器與試劑 采用德國Leica 1010全封閉脫水機，德國Leicarm 2245全自動切片機，Leicaauto Stainer XL全自動染色機，日本 Olympus pm－20顯微機及 Olympus pm－C35DX成像系統(tǒng)。采用鼠抗人Cyclin E單克隆抗體，兔抗人p53多克隆抗體，鼠抗人PTEN單克隆抗體，PV.6000.G二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB顯色液，防脫片劑APES，試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化 采用En Vision二步法。

1.3.2 免疫對照 免疫組化En Vision法用PBS代替一抗做陰性對照，以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性標準。

1.3.3 結(jié)果判定 （1）Cyclin E以細胞核內(nèi)呈明顯棕黃色著色為陽性細胞。高倍鏡下進行觀察，按陽性細胞率及染色定位，將Cyclin E蛋白染色結(jié)果分為2級，進行半定量測定：①正常，正確定位表達細胞數(shù)大于10%視為正常表達；②異常，染色細胞小于10%或染色部位改變（定位于細胞質(zhì)或細胞核）都視為異常表達。（2）p53在高倍鏡視野下每張切片選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算出陽性細胞的百分比，用百分率表示［即陽性細胞率＝（陽性細胞數(shù)／100）×100%］，然后根據(jù)陽性細胞百分比記分（小于20%為陰性表達，大于20%為陽性表達）。（3）PTEN蛋白表達，PTEN蛋白陽性定位于胃癌細胞質(zhì)，呈棕黃色。每例切片按染色強度及陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞（同類細胞）總數(shù)的百分比綜合計分。染色強度：未著色（0分），淺黃色（1分），棕黃色（2分），棕褐色（3分）；陽性細胞數(shù)：小于5%（0分），6%～25%（1分），26%～50%（2分），大于50%（3分）。2項分值之積：小于3計為陰性（－），3～5計為陽性（＋），大于5為強陽性（＋＋）。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0軟件進行分析，采用χ2檢驗及采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Cyclin E、p53及PTEN在胃正常黏膜及胃癌組織中的表達情況 65例胃癌組織中，Cyclin E呈陽性表達40例（61.54%），p53呈陽性表達43例（66.15%），PTEN 呈陽性表達30例（46.15%）。12例胃正常黏膜中 Cyclin E、p53及PTEN的陽性表達率分別為（7.69%、30.76%、92.31%）。3種基因蛋白在上述兩組表達的陽性率之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1，見封2圖1～4、封3圖5～6。

表1 Cyclin E、p53、PTEN在胃癌和胃正常黏膜中的表達

2.2 Cyclin E、p53、PTEN蛋白表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 Cyclin E、p53及PTEN蛋白表達與胃癌患者性別、年齡、大小均無關(guān)（P＞0.05），與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。Cyclin E的表達與浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及有否遠處轉(zhuǎn)移均有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與胃癌的年齡、性別、大小無顯著相關(guān)（P＞0.05）；p53蛋白陽性表達在胃癌的浸潤深度、分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同的TNM分期及有無遠處轉(zhuǎn)移中差異均有顯著相關(guān)性（P＜0.05）；PTEN表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及有無遠處轉(zhuǎn)移間比較均有顯著相關(guān)性（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤的大小程度無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

2.3 胃癌中Cyclin E、p53、PTEN表達之間的相關(guān)性 65例胃癌中，Cyclin E與p53共同陽性表達的有31（47.69%），而Cyclin E陰性和p53陽性分別為12例（18.46%）、而Cyclin E陽性和p53陰性分別為9例（13.85%），Cyclin E與p53共同陰性表達的有13例（20%）。經(jīng)統(tǒng)計學分析，p53和Cyclin E在胃癌中的表達呈明顯的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），在胃癌組織中p53蛋白的異常表達強度隨著Cyclin E蛋白表達強度的增強而升高，見表2。

表2 Cyclin E與p53在胃癌中表達的相關(guān)性分析（n）

65例胃癌中，14例Cyclin E、PTEN均呈陽性表達（21.54%），9例均呈陰性表達（13.85%），Cyclin E表達陽性而PTEN表達陰性者為26例（40%），Cyclin E表達陰性而PTEN表達陽性者為16（24.62%），Cyclin E與PTEN表達呈負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.283，P＝0.022），見表3。

表3 Cyclin E與PTEN在胃癌中表達的相關(guān)性分析（n）

43例p53陽性表達的胃癌患者中，有16例PTEN也為陽性表達（24.62%）；22例p53陽性表達的胃癌患者中，有8例PTEN為陰性表達（12.31%），兩者間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。胃癌中p53與PTEN表達呈負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.251，P＝0.044），見表4。

表4 p53與PTEN在胃癌中表達的相關(guān)性分析（n）

3 討 論

Cyclin E是細胞周期蛋白中的一種，Cyclin E的主要作用促進DNA復制的起始，異常情況下，Cyclin E由于無順序、無計劃的過度表達而存在于整個細胞周期中，Cyclin E基因定位于染色體19q12～13，編碼395個氨基酸，其中第128～215為周期蛋白盒［1－5］。文獻報道［6－8］，Cyclin E 異常表達與許多 腫 瘤的發(fā)生密切相關(guān)。已證實Cyclin E的異常表達可作為腫瘤增殖的標志［9］。Cyclin E過度表達與細胞的腫瘤變性明顯相關(guān)［10］，有研究結(jié)果表明，Cyclin E表達與年齡、性別、腫瘤的組織類型、腫瘤的大小無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、組織學分期明顯相關(guān)。但是，劉曉波等［6］的研究證實，Cyclin E的表達與腫瘤病理學分級有顯著相關(guān)性，隨著腫瘤惡性程度的升高、分化程度的降低，Cyclin E的表達率增加，而與TNM分期無關(guān)。這些結(jié)果也說明Cyclin E蛋白陽性表達在胃癌的進展中起重要作用，并提示Cyclin E的異常表達可能是胃癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的機制之一。

p53基因蛋白位于17號染色體短臂17p13.1上，其蛋白產(chǎn)物定位于細胞核，為一種含393個氨基酸的核蛋白，相對分子質(zhì)量約為53×103。野生型p53的作用主要是抑制細胞過度增殖、誘導凋亡，協(xié)調(diào)細胞凋亡與增殖速度；并防止細胞的異常蓄積和惡性轉(zhuǎn)化。p53基因突變后表達則失去抑制細胞增殖、導致細胞增殖過度。p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)的與胃癌關(guān)系最密切的腫瘤抑制基因。p53的缺失或突變已被證實與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。金順花等［11］采用免疫組化SP法研究72例胃癌和癌旁組織及20例正常胃黏膜中的p53蛋白，提示胃癌組織中p53蛋白總陽性表達率為52.78%，其中p53蛋白表達與胃癌分化程度、腫瘤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等因素有顯著性關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，突變型的p53在胃癌中的表達率為66.15%，在周圍正常組織中的表達率為30.76%，表明突變型p53蛋白與胃癌發(fā)生密切相關(guān)。p53蛋白表達的陽性率與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小無關(guān)，但與浸潤深度、組織學分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。

PTEN于1997年由Li等［12］3個研究小組先后克隆并命名，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，國內(nèi)有研究表明，PTEN蛋白的表達下調(diào)或缺失與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及新生血管的形成密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在胃癌組織中的表達率為46.15%，顯著低于在正常胃組織中的表達92.31% （P＜0.05），并隨腫瘤浸潤深度的加深、病理分化程度的降低、淋巴轉(zhuǎn)移的發(fā)生、臨床分期的增高及遠處轉(zhuǎn)移而降低（P＜0.05），提示PTEN基因表達的缺失與胃癌的轉(zhuǎn)移和浸潤密切相關(guān)，而且可能為胃癌的惡性程度提供依據(jù)。本研究顯示，PTEN蛋白的表達與癌組織分化程度密切相關(guān)，隨著分化程度降低，表達率減低，表明分化程度越高，PTEN陽性率越高，分化越差，表達越弱，提示PTEN在誘導腫瘤分化過程中起重要作用。

黎家慶等［13］在早期胃癌中觀察到了Cyclin E表達陽性者比陰性者地表達p53，認為Cyclin E和p53之間可能存在某種關(guān)系；在黏膜下層胃癌中觀察到了Cyclin E陽性和強陽性者比陰性組顯著頻繁地表達了p53，與同時包括早、晚期胃癌病例的研究結(jié)果一致，提示黏膜下層胃癌中過度表達的Cyclin E與p53之間可能具有某種相互促進的關(guān)系。本組Cyclin E過度表達陽性者比陰性者頻繁地表達p53，Cyclin E過度表達與突變型p53蛋白有顯著相關(guān)性，呈正相關(guān)。此結(jié)果進一步支持Cyclin E過度表達和p53之間可能存在某種關(guān)系的推論，具有Cyclin E和p53同時過度表達的胃癌可能增殖更快、惡性度更高。

PTEN蛋白調(diào)節(jié)細胞周期，抑制細胞增殖。本研究結(jié)果也證實了這一點，胃癌組織中Cyclin E表達與PTEN的表達呈負相關(guān)關(guān)系（r＝－0.283），Cyclin E的陽性表達隨著PTEN表達程度的降低而增強，說明PTEN缺失或表達下降，Cyclin E的過度表達，可導致細胞異常增殖、細胞癌變的發(fā)生。

綜上所述，Cyclin E和p53在胃癌中顯著高表達，他們在胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移中可能起重要作用；PTEN在胃癌中低表達，這三者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展轉(zhuǎn)移中起相互抑制作用。檢測Cyclin E、p53和PTEN可作為反映胃癌病理學特點的參考指標。

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The expression of Cyclin E，p53 and PTEN in gastric carcinoma and the clinical significance

Xie Zhihui1，Wang Lei2，Chen Jin1，Jin Linfang3

（1.Department of General Surgery；2.Department of Surgery；3.Department of Pathology，the Fourth Hospital Affiliated of Suzhou University，Wui，Jiangsu214062，China）

ObjectiveTo explore the expression and significance of CyclinE，p53，and PTEN in gastric carcinoma.MethodsImmunohistochemistry Envision two step system was used to detect the expression level of CyclinE、p53and PTEN in sixty five gastric cancer samples with thirteen of normal gastric tissue as a control.Results1.The expression rate of Cyclin E in gastric cancer tissues was high，which went up with increasingly invasive depth，occurring lymphatic metastasis，and clinical stages，reduced histological differentiation and long distance metastasis（P＜0.05）.2.The expression rate of p53in gastric cancer tissues was high，and increased with increasingly invasive depth and clinical stages，reduced histological differentiation，occurring of lymphatic metastasis and long distance metastasis（P＜0.05）.3.The expression rate of PTEN in gastric cancer tissues was low，and reduced with increased invasive depth and clinical stages，reduced histological differentiation，occurring of lymphatic metastasis and long distance metastasis（P＜0.05）.4.In gastric cancer，the expression of PTEN and p53，Cyclin E were of inverse correlation.The relationship between the expression of Cyclin E and p53were negative（P＜0.05）.ConclusionCyclin E，p53and PTEN relatively could be a marker in biological behavior of gastric cancer and estimation of prognosis，then it is suggested that combined detection may have higher accurate rate.

stomach heoplasms；Cyclin E；p53；PTEN；biological behavior

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.009

A

1671－8348（2012）35－3710－03

2012－07－02

2012－09－18）

·臨床研究·