外周血雙陰性T細胞升高與臨床疾病的關系＊

趙 雪，吳麗娟，劉毓剛

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科／成都軍區(qū)檢驗醫(yī)學中心，成都610083；2.四川省達州市中心醫(yī)院檢驗科 635000）

外周血雙陰性T細胞升高與臨床疾病的關系＊

趙 雪1，2，吳麗娟1△，劉毓剛1

（1.成都軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科／成都軍區(qū)檢驗醫(yī)學中心，成都610083；2.四川省達州市中心醫(yī)院檢驗科 635000）

目的了解外周血雙陰性T細胞（DNT）含量升高的臨床疾病譜，探討DNT升高的臨床意義。方法回顧性分析2010年1月至2012年2月，收治患者中接受外周血T淋巴細胞亞群檢測且DNT升高的病歷資料，以臨床診斷為金標準，按照疾病分類統(tǒng)計分析。T淋巴細胞亞群檢測采用流式細胞學檢測技術。結果健康人外周血DNT占淋巴細胞的（7.36±2.13）%，含量達（0.13±0.06）×109／L。送檢患者中約有5.45%的外周血DNT增高，主要見于肺部細菌感染、全身性病毒感染、不明原因發(fā)熱、胸膜炎、急性扁桃體炎、創(chuàng)傷、腦膜炎等。DNT在外周血淋巴細胞中的比例增高和絕對含量增高均以急性扁桃體炎為最高，不明原因的發(fā)熱次之。增高患者中又以13～17歲青少年患者DNT升幅為最大。結論外周血DNT主要是在臨床急性炎癥性疾病時明顯升高，可能參與了急性感染、嚴重創(chuàng)傷等患者的細胞免疫調節(jié)。

流式細胞術；外周血；雙陰性T細胞；疾病譜

雙陰性 T細胞（double－negative T－cell，DNT）是淋巴細胞亞群中的一種，免疫學標志為CD3＋CD4－CD8－，因其細胞表面沒有CD4、CD8表達而被稱為雙陰性［1－2］。近年來，由于多色流式細胞分析儀的誕生，DNT細胞的檢測成為可能。在日常外周血T淋巴細胞亞群分析中，只要采用CD3－CD4－CD8的三色流式細胞術即可從淋巴細胞群中很容易地將DNT細胞區(qū)分出來并加以測定［3］。本文回顧性分析本院近期外周血淋巴細胞亞群檢測中DNT異常升高的患者資料，以明確外周血DNT含量的參考范圍及其異常升高與臨床疾病的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2010年1月至2012年2月，本院臨床送驗T細胞亞群的病例1 780例，DNT細胞升高97例，其中男72例，女25例，年齡1～77歲，平均28.2歲。對照組63例，為近期健康體檢被證實的健康個體，其中男33例，女30例，年齡15～63歲，平均30.5歲。

1.2 標本采集 清晨采集靜脈血2～3mL，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA－2K）抗凝（紫頭真空采血管），立即檢驗。

1.3 流式T細胞亞群的檢測 采用雙平臺三色熒光全血細胞直接染色免洗流式測定法、SSC／FSC設門淋巴細胞，分析總T細胞（CD3＋）、T4細胞（CD3＋CD4＋CD8－）、T8細胞（CD3＋CD4－CD8＋）、DNT（CD3＋CD4－CD8－）百分含量和絕對含量，計算T4／T8細胞比值。全部試劑如同型對照抗體IgG1－FITC／IgG1－PE／IgG1－PC5，測 定 抗 體 CD4－FITC／CD8－PE／CD3－PC5、標本預處理試劑等均為美國Beckman－Coulter公司產品，儀器采用Beckman－Coulter XL4－MCL型流式細胞儀。具體檢測方法參照文獻［3］進行。

1.4 診斷標準 以對照組DNT細胞百分含量和絕對含量的（＋2s）為臨界值，大于該水平即被認為增高。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，計量資料組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 外周血DNT增高的疾病分布 1 780例患者中DNT增高97例，增高率5.45%。97例DNT增高患者中臨床資料齊全的共54例，包括肺部細菌感染14例（26.4%），全身性病毒感染11例（20.8%），不明原因發(fā)熱6例（11.3%），胸膜炎6例（11.3%），急性扁桃體炎5例（9.4%），創(chuàng)傷3例（5.6%），腦膜炎2例（3.7%），潰瘍性結腸炎1例（1.9%），退行性脊椎炎1例（1.9%），椎間盤突出1例（1.9%），氣胸1例（1.9%），慢性腎功能不全1例（1.9%），高血壓1例（1.9%），白內障1例（1.9%）。2.2 DNT增高患者的外周血DNT水平 DNT在外周血淋巴細胞中的比例以急性扁桃體炎患者最高，約占淋巴細胞的1／2；其次是不明原因的發(fā)熱患者，約占淋巴細胞的1／4；其余依次是肺部細菌感染、全身性病毒感染、胸膜炎和創(chuàng)傷。DNT絕對含量以急性扁桃體炎患者最高，其余依次是不明原因的發(fā)熱患者、創(chuàng)傷、肺部細菌感染、全身性病毒感染、胸膜炎，見表1。

表1 外周血DNT增高患者的流式檢測結果（±s）

表1 外周血DNT增高患者的流式檢測結果（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對照組比較。

組別 n 絕對含量（×109／L）對照組63 0.13±0.06肺部細菌感染組 14 0.27±0.26b全身性病毒感染組 11 0.21±0.15b不明原因發(fā)熱組 6 0.82±1.30b胸膜炎組 6 0.19±0.05a急性扁桃體炎組 5 2.68±1.36b創(chuàng)傷組 3 0.29±0.05a其他疾病組 9 0.25±0.13a

2.3 外周血DNT增高與患者年齡的關系 將97例外周血DNT增高患者按照年齡進行分組。數據顯示13～17歲青少年人群DNT升幅最大，DNT平均可增高到占淋巴細胞的1／3以上，絕對含量可增加一個數量級，結果見表2。

表2 不同年齡外周血DNT細胞含量升高水平（±s）

表2 不同年齡外周血DNT細胞含量升高水平（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與0～3歲組比較；c：P＜0.05，d：P＜0.01，與4～12歲組比較；e：P＜0.05，f：P＜0.01，與13～17歲組比較。

年齡組 n 絕對含量（×109／L）0～3歲組 12 0.89±1.01e 4～12歲組 23 0.53±0.59f 13～17歲組 7 2.07±1.79bd 18～60歲組 48 0.24±0.16af＞60組 7 0.18±0.06af

3 討 論

正常情況下，T細胞占淋巴細胞總數的65%以上，是人類最重要的免疫效應細胞。T細胞（CD3＋淋巴細胞）包括T4細胞（CD3＋CD4＋CD8－，也稱 CD4＋T 細胞）、T8細胞（CD3＋CD4－CD8＋，也稱CD8＋T細胞）、DNT（CD3＋CD4－CD8－）和雙陽性T細胞（CD3＋CD4＋CD8＋，簡稱DPT）等亞群［3－4］。Fischer等［5］采用密度梯度離心法分離了20例健康人的外周血單個核細胞，以CD3、CD4、CD8、TCRαβ、TCRγδ熒光標記抗體染色，用流式細胞儀對其中的DNT進行了分析，結果發(fā)現DNT占CD3＋細胞的4.1%（1.9%～7.7%）。對這些DNT的進一步鑒定證實，健康人外周血中的DNT細胞主要表達TCRγδ（平均3.2%，范圍2.1%～3.6%），TCRαβ＋的 DNT細胞僅占0.9%（0.4%～1.9%）。上述結果表明，健康人外周血中是存在一定數量的DNT細胞的。本實驗室2005年采用全血細胞直接染色免洗流式測定法，對200例健康人進行了外周血DNT含量調查，結果顯示健康人外周血中DNT的百分含量占淋巴細胞的12.33%以內，絕對含量達到（0.24～1.08）×109／L水平［3］。之后立即在流式細胞術外周血T細胞亞群檢測中向臨床回報DNT百分含量和絕對含量檢測結果。本研究對本院近一段時間臨床標本中DNT含量增高的患者進行了調查分析，同樣證實健康人外周血中含有（7.36±2.13）%、（0.13±0.06）×109／L的 DNT；發(fā)現在臨床送驗的各種疾病患者的外周血樣中大約有5.45%的患者存在DNT增高的情況，其中主要是肺部細菌感染、全身性病毒感染、不明原因發(fā)熱、胸膜炎、急性扁桃體炎等；急性扁桃體炎時，外周血DNT甚至可以占到淋巴細胞的一半以上，每升全血中的DNT含量可以達到109水平；并且發(fā)現在13～17歲年齡階段的患者，其DNT增高的幅度最大。本研究與Fischer K等［5］的報道在數值上存在一定差異，這可能與采取的方法以及觀察對象人種不同有關。采用傳統(tǒng)方法在單個核細胞提取時可能造成部分DNT丟失，而染色后的洗滌過程可能引起熒光抗體的部分脫落，導致檢驗結果偏低。因此，筆者推薦外周血淋巴細胞亞群分析應盡量采取新一代全血細胞直接染色免洗流式測定法，其檢測結果更為準確。

外周血DNT細胞的來源目前尚不清楚。有學者以鼠為動物模型研究提示，DNT可能來自CD8＋T細胞的前體細胞［6］，但是 MacDonald［7］則認為 DNT 細胞有自己獨特的分化途徑并非依賴CD8＋細胞，肯定存在一種胸腺分化外途徑。Zhang等［8］發(fā)現存在αβ－TCR＋、CD3＋、CD4－、CD8－、CD25＋、CD28－、CD44－、NK1.1－這樣一群獨特的DNT細胞，也提示可能存在胸腺以外的形成途徑。

在功能方面，目前已證實DNT細胞能夠抑制具有相同T細胞受體的CD8＋T細胞和CD4＋T細胞的功能［1］。Strober等［9］首次發(fā)現αβ－TCR＋雙陰性NKT細胞具有抑制功能并誘導免疫耐受，隨后Johansson等［10］在轉基因小鼠體內分離出無反應性的NK1.1－DN T細胞。也有學者報道人類DNT細胞具有一定的抑制性免疫調節(jié)功能［11］。本研究顯示，外周血DNT升高主要見于臨床炎癥性疾病，包括感染性和非感染性疾病，結合上述國外研究成果，筆者推測炎癥性疾病時外周血DNT增高可能參與了對體內T4、T8細胞功能的調節(jié)，通過對過高T4或T8細胞應答的抑制來預防體內細胞免疫應答的過度亢進，防止過度免疫反應對機體造成免疫損傷?；谏鲜鐾茰y，筆者認為青少年患者外周血DNT細胞增高的幅度遠遠大于其他年齡段患者的情況，是因為青少年人群T細胞發(fā)育已經完全成熟，且T細胞的功能正值旺盛時期，機體遭遇外來抗原刺激時其反應性強于低齡段和高齡段人群的T細胞，因此需要更多的DNT細胞來平衡強烈的T細胞應答。

因此，檢測外周血DNT十分重要，它是急性感染、嚴重創(chuàng)傷等患者體內的免疫功能狀態(tài)、病情監(jiān)測的一個新指標。進一步開展有關外周血DNT來源、特性、功能、表達及激活機制的研究，或許能探索出一條嶄新的臨床治療路徑，推動未來相關疾病的免疫治療。

［1］Naito T，Tanaka H，Naoe Y，et al.Transcription control of T－cell development［J］.Int Immunol，2011，23（11）：661－668.

［2］Lev A，Simon AJ，Amariglio N，et al.Hymic functions and gene expression profile distinct double－negative cells from single positive cells in the autoimmune lymphoproliferative syndrome［J］.Autoimmun Rev，2012，11（10）：723－730.

［3］吳麗娟.臨床流式細胞學檢驗技術［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2010：78－88.

［4］竇肇華，張遠強，郭順根.免疫細胞與疾?。跰］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2004：1－127.

［5］Fischer K，Voelkl S，Heymann J，et al.Isolation and characterization of human antigen－specific TCR αβ＋CD4－CD8－double－negative regulatory T cells［J］.Blood，2005，105（7）：2828－2835.

［6］Zhang ZX，Yong KJ，Zhang L.CD3＋CD4－CD8－αβ－T cell as immune regulatory cell［J］.J Mol Med（Berl），2001，79（8）：419－427.

［7］MacDonald HR.Development and selection of NKT cells［J］.Curr Opin Immunol，2002，14（2）：250－254.

［8］Zhang ZX，Yang L，Young KJ，et al.Identification of a previously unknown antigen－specific regulatory T cell and its mechanism of suppression［J］.Nat Med，2000，6（7）：782－789.

［9］Strober S，Cheng L，Zeng D，et al.Double negative（CD4－CD8－alpha beta＋）T cells which promote tolerance induction and regulate autoimmunity［J］.Immunol Rev，1996，149（1）：217－230.

［10］Johansson M，Lycke N.A unique population of extrathymically derived alpha beta TCR＋CD4－CD8－T cells with regulatory functions dominates the mouse female genital tract［J］.J Immunol，2003，170（4）：1659－1666.

［11］張竹虛，張麗.αβ－TCR＋CD3＋CD4－CD8－雙陰性 T細胞：一種新發(fā)現的免疫調節(jié)T細胞［J］.現代免疫學，2004，24（1）：5－8.

The relationship between the increase of double negative T cell in peripheral blood and clinical disease＊

Zhao Xue1，2，Wu Lijuan1△，Liu Yugang1
（1.Department of Medical Laboratory，Chengdu Military General Hospital，Chengdu，Sichuan610083，China；2.Department of Medical Laboratory，Dazhou Central Hospital，Dazhou，Sichuan635000，China）

ObjectiveTo analyze the clinical spectrums of disease of abnormal elevation of double negative T cells in peripheral blood，and identify the clinical significance of double negative T cells（DNT）increase.MethodsWe did a retrospective analysis of the medical data of patients who were DNT increased in peripheral blood obtained from January 2010to February 2012.Our research set clinical diagnosis as gold standard and we conducted the statistical analysis in accordance with the classification of diseases.T lymphocyte subsets were assessed by flow cytometry.ResultsThe DNT percentage and absolute quantity was（7.36±2.13）%and（0.13±0.06）×109／L in healthy people.There were about 5.45%patients had an increased DNT levels in all delivered T cell subset examination patients.DNT increasing in peripheral blood mainly found in pneumonic bacterial infection，general viral infection，innubibus fever，pleuritis，acute tonsillitis，trauma and cephalomeningitis，etc.Acute tonsillitis patients had the highest percentage and absolute quantity increase of DNT，followed by innubibus fever.In addition，adolescents aged 13to 17had the highest increase of DNT.ConclusionDNT were significantly increased in peripheral blood of acute inflammation patients，and it maybe take part in regulating cell immunity in patients with acute infection，severe trauma，etc.

flow cytometry；peripheral blood；double negative T cell；disease spectrum

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.35.006

A

1671－8348（2012）35－3702－02

四川省科技廳基金資助項目（2011JY0037）。 △

，Tel：（028）86571052；E－mail：wulijuan1638＠126.com。

2012－06－09

2012－08－22）

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