他克莫司對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化早期CTGF、VEGF表達(dá)的影響

閔亞麗，趙冬慧，于 黔

（貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科 550004）

他克莫司對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化早期CTGF、VEGF表達(dá)的影響

閔亞麗，趙冬慧，于 黔

（貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科 550004）

目的探討不同劑量的他克莫司（FK506）對(duì)腎小管上皮細(xì)胞（HKC）轉(zhuǎn)分化的作用及其對(duì)早期結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的影響。方法以體外培養(yǎng)的HKC為研究對(duì)象，分4組：（1）對(duì)照組；（2）轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（TGF－β1）（8ng／mL）組；（3）FK506（10、30、60ng／mL）組；（4）TGF－β1（8ng／mL）加 FK506（10、30、60ng／mL）組。應(yīng)用形態(tài)學(xué)、免疫組化技術(shù)、和半定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）觀察FK506對(duì)TGF－β1誘導(dǎo)的HKC轉(zhuǎn)分化的作用及對(duì)α－SMA、CTGF、VEGF表達(dá)的影響。結(jié)果與對(duì)照組比較，48h后TGF－β1組HKC細(xì)胞呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形外觀，α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA）、CTGF、VEGF的表達(dá)明顯增多（P＜0.01），F(xiàn)K506組α－SMA、VEGF及CTGF的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TGF－β1加FK506組比TGF－β1組α－SMA、VEGF及CTGF隨FK506的濃度增加表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論FK506對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化早期可能通過(guò)下調(diào)VEGF、CTGF的表達(dá)起抑制作用。

他克莫司；腎小管；細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子類；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子

腎間質(zhì)纖維化是指由多種原因引起的細(xì)胞外基質(zhì)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過(guò)度沉積，是各種慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同最終通路［1］。由于腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）在腎間質(zhì)纖維化變化中的重要性已經(jīng)為人們認(rèn)識(shí)，所以積極探索有效的預(yù)防、抑制甚至逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生對(duì)治療腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展有重要意義［2］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1（TGF－β1）是非常重要的促纖維化因子，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是TGF－β1發(fā)揮作用的下游效應(yīng)因子。VEGF是血管新生的主要促進(jìn)因子［3］。大量表達(dá)的VEGF可加重平滑肌細(xì)胞增生及血管壁增厚，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分在內(nèi)皮細(xì)胞外堆積，導(dǎo)致腎臟纖維化。FK506臨床主要應(yīng)用于器官移植排斥反應(yīng)等的治療，近年開(kāi)始用于免疫性腎臟疾病、結(jié)締組織病等的治療，但FK506對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用如何研究甚少。本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察FK506對(duì)TGF－β1誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的早期影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人類腎小管上皮細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 試劑 他克莫司由安斯泰來(lái)公司惠贈(zèng)；DMEM／F12購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Thermo公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、胎牛血清（FBS）購(gòu)自北京中山公司；人重組TGF－β1購(gòu)自Peprotech公司；兔抗人CTGF多克隆抗體，兔抗人VEGF多克隆抗體購(gòu)自山海天呈公司；TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；RT－PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Formentas公司；CTGF、VEGF及α－平滑肌肌動(dòng)蛋白（α－SMA）引物合成（上海生工）。

1.3 方法

1.3.1 HCK細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 HKC細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM／F12，5%FBS、100U／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，細(xì)胞傳代采用0.25%胰蛋白酶消化。將細(xì)胞按照1×106C個(gè)／孔接種于孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%，換用無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24h。以未處理的 HKC為對(duì)照組，以 TGF－β1（8ng／mL）單獨(dú)處理48h的HKC為TGF－β1組，以不同濃度FK506單獨(dú)處理細(xì)胞48h為FK506（10、30、60ng／mL）組，以8ng／mL TGF－β1加不同濃度的FK506共同處理細(xì)胞48h為 TGF－β1加 FK50（10、30、60 ng／mL）組。然后每4小時(shí)在倒置顯微鏡下觀察1次細(xì)胞形態(tài)。48h后拍照，收集爬片及細(xì)胞分別進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 細(xì)胞免疫組化方法測(cè)定各組 HKC細(xì)胞CTGF及VEGF蛋白的表達(dá) 獲得細(xì)胞爬片后，以冷PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定20min后吸干，加入PBS水化。0.1%Tritonx－100室溫30min，0.3%H2O2室溫20min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，5%山羊血清血清室溫30min，封閉非特異性抗原，分別加兔抗人CTGF及VEGF多克隆抗體（1∶200、1∶150）4℃過(guò)夜。再分別與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗37℃孵育40min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、樹(shù)脂封片；用PBS替代一抗做空白對(duì)照，顯微鏡下觀察并照相。

1.3.3 RT－PCR測(cè)定細(xì)胞mRNA水平的表達(dá) 按TRizol說(shuō)明書提取細(xì)胞中的總RNA，紫外分光光度機(jī)對(duì)RNA定量，用Oligo（dT）引物進(jìn)行樣品RNA（200ng）的反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。α－SMA上游5′－GCT CAC GGA GGC ACC CCT GAA－3′下游5′－CTG ATA GGA CAT TGT TAG CAT－3′。CTGF上游5′－CGG CTT ACC GAC TGG AAG AC－3′下 游 5′－CGT CGG TAC ATA CTC CAC AG－3′。VEGF上游5′－ACC ATG AAC TTT CTG CTG TC－3′下游5′－TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC－3′。GAPDH 上 游 5′－CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG－3′下游5′－GTC CAC CAC CCT GTT GCT GTA G－3′（上海生工）。Real－Time PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5μL；MgCl2溶液3μL；dNTP混合液3μL；Taq聚合酶3 μL；20μmol／L的PCR特異性上游引物0.5μL；20μmol／L的PCR特異性下游引物0.5μL；cDNA 2μL；加水至總體積為25 μL。反應(yīng)體系置于Real－Time PCR儀上。分別反應(yīng)條件：（1）94℃變性3min；35個(gè)PCR循環(huán)：94℃變性30s；58℃退火30 s；72℃延伸60s。（2）95℃變性1min；45個(gè)PCR循環(huán)：95℃變性10s；60℃退火1s；72℃延伸10s。（3）94℃變性3min；35個(gè)PCR循環(huán)：94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸45 s。（4）94℃變性3min；35個(gè)PCR循環(huán)：94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠100V 50min，結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件進(jìn)行電泳條帶分析，α－SMA基因的濃度除以GAPDH基因的濃度，即為α－SMA基因校正后的相對(duì)含量。CTGF基因的濃度除以GAPDH基因的濃度，即為CTGF基因校正后的相對(duì)含量。VEGF基因的濃度除以GAPDH基因的濃度，即為VEGF基因校正后的相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 12.0軟件對(duì)結(jié)果中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的觀察 對(duì)照組及FK506各濃度組HKC細(xì)胞生長(zhǎng)6d后，形成融合的單層上皮細(xì)胞，呈橢圓形的鋪路石樣的形態(tài)學(xué)特征。加TGF－β1培養(yǎng)48h后細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣梭形外觀，且細(xì)胞生長(zhǎng)排列紊亂，細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化。同時(shí)加入不同劑量的FK506和TGF－β1共同作用組，觀察到部分細(xì)胞形態(tài)維持正常的細(xì)胞形態(tài)，仍存在部分發(fā)生形態(tài)改變的細(xì)胞，似成纖維細(xì)胞樣。

2.2 FK506對(duì)α－SMA mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組少量表達(dá)α－SMA mRNA，不同濃度FK506作用48h后，較對(duì)照組α－SMA mRNA表達(dá)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TGF－β1干預(yù)48h后，較對(duì)照組α－SMA mRNA表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），F(xiàn)K506可以減少 TGF－β1誘導(dǎo)的 α－SMA mRNA表達(dá)，且隨著FK506劑量的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

2.3 FK506對(duì)CTGF及VEGF表達(dá)的影響

2.3.1 細(xì)胞免疫組化SP法檢測(cè)CTGF及VEGF表達(dá)的變化將每張片在×100高倍鏡下，順時(shí)針盲法計(jì)算15個(gè)高倍視野中，陽(yáng)性細(xì)胞百分率＝總陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。對(duì)照組和FK506各濃度組CTGF陽(yáng)性細(xì)胞占總HKC細(xì)胞的面積比值均很低（3.21%～4.13%），各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TGF－β1組見(jiàn)大量細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色，為CTGF表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞占總HKC細(xì)胞的面積比值是15.42%，與對(duì)照組和FK506各濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與 TGF－β1 組 比 較，加 入 FK506（10、30、60 ng／mL）共同作用48h后，CTGF陽(yáng)性細(xì)胞占總HKC細(xì)胞的面積比值分別為11.83%、9.25%、6.54%，呈劑量依賴性（P＜0.05）。見(jiàn)封3圖2。對(duì)照組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞占總HKC細(xì)胞的面積比值7.54%，F(xiàn)K506各濃度組（7.2%～7.6%）與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），TGF－β1組見(jiàn)大量細(xì)胞胞質(zhì)中呈棕黃色，為VEGF表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞占總HKC細(xì)胞的面積比值是23.07%，與對(duì)照組和FK506各濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與 TGF－β1組比較，TGF－β1加 FK506（10、30、60ng／mL）組作用48h后，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞占總 HKC細(xì)胞的面積比值分別為17.28%、14.25%、10.21%，呈劑量依賴性（P＜0.05）。見(jiàn)封3圖3。

2.3.2 RT－PCR定量檢測(cè) 對(duì)照組少量CTGF mRNA的表達(dá)，TGF－β1干預(yù)48h后，較對(duì)照組CTGF mRNA表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），F(xiàn)K506各濃度組作用48h后，較對(duì)照組CTGF mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但 TGF－β1加FK506（10、30、60ng／mL）組作用48h后可減少 TGF－β1誘導(dǎo)的CTGF mRNA表達(dá)，且隨著FK506劑量的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖4、表1。

表1 FK506對(duì)各組細(xì)胞α－SMA mRNA、CTGF mRNA及VEGFF mRNA含量的變化（±s，%，n＝3）

表1 FK506對(duì)各組細(xì)胞α－SMA mRNA、CTGF mRNA及VEGFF mRNA含量的變化（±s，%，n＝3）

△：P＜0.05，與TGF－β1組比較；＃：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別α－SMA mRNA CTGF mRNA VEGF mRNA對(duì)照組0.187±0.037 0.543±0.001 0.495±0.734 FK506 10ng／mL組 0.178±0.033 0.512±0.011 0.485±0.070 FK506 30ng／mL組 0.180±0.041 0.489±0.002 0.535±0.021 FK506 60ng／mL組 0.175±0.037 0.468±0.095 0.491±1.027 TGF－β1組 1.199±0.200＃ 1.877±0.047＃ 1.555±0.043＃TGF－β1＋FK506 10ng／mL組 0.666±0.063△ 0.702±0.045△ 0.936±1.002△TGF－β1＋FK506 30ng／mL組 0.465±0.114△ 0.672±0.017△ 0.688±2.021△TGF－β1＋FK506 60ng／mL組 0.317±0.023△ 0.606±0.022△ 0.442±1.030△

對(duì)照組有基礎(chǔ)量VEGF mRNA的表達(dá)，TGF－β1干預(yù)48h后，對(duì)照組VEGF mRNA表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），不同濃度FK506作用48h后，較對(duì)照組VEGF mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但 TGF－β1加 FK506（10、30、60ng／mL）組作用后可減少TGF－β1誘導(dǎo)的 VEGF mRNA表達(dá)，且隨著FK506劑量的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)，并呈劑量依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖5、表1。

圖1 RT－PCR測(cè)定不同組α－SMA及內(nèi)對(duì)照GAPDH的mRNA表達(dá)

圖4 RT－PCR測(cè)定不同組CTGF及內(nèi)對(duì)照GAPDH的mRNA表達(dá)

圖5 RT－PCR測(cè)定不同組VEGF及內(nèi)對(duì)照GAPDH的mRNA表達(dá)

3 討 論

大量研究已證實(shí)，在腎臟中TGF－β1可以活化成纖維細(xì)胞、促進(jìn)小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、刺激ECM合成，使腎小管上皮細(xì)胞表型發(fā)生改變，失去表達(dá)細(xì)胞角蛋白，鈣粘蛋白等上皮細(xì)胞標(biāo)記抗原，開(kāi)始表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物如α－SMA［4－5］。本實(shí)驗(yàn)使用TGF－β1作為直接的刺激因子，對(duì) HKC作用48h后，細(xì)胞拉長(zhǎng)、肥大呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣梭形外觀，且細(xì)胞生長(zhǎng)排列紊亂。CTGF是TGF－β1發(fā)揮致纖維化作用的下游效應(yīng)因子，TGF－β1可通過(guò)Ⅰ型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（TβRI）／激活素受體樣激酶5（ALK－5）依賴Smad2信號(hào)途徑促進(jìn)CTGF的表達(dá)。CTGF是TGF－β1的正反饋因子，放大TGF－β1的作用，而不影響其抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用，是一個(gè)更加理想的抗纖維化靶點(diǎn)［6－7］。

VEGF是維持血管內(nèi)皮細(xì)胞生存、再生及其功能的重要因子［8］。在生理狀態(tài)下，腎臟有基礎(chǔ)量的VEGF的表達(dá)，對(duì)維持腎血管結(jié)構(gòu)及正常生理功能是必需的［9］。大量表達(dá)的VEGF可介導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞和腎小球足突細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)而參與腎小球硬化的發(fā)生［10－11］，增加腎小球?yàn)V過(guò)屏障的通透性、使多種炎癥因子滲出和分泌，加劇炎性反應(yīng)［12］，促進(jìn)腎臟纖維化。在近來(lái)的研究中，TGF－β1與VEGF關(guān)系的研究也取得了顯著進(jìn)展。TGF－β1可能通過(guò)蛋白激酶C途徑上調(diào)近端小管上皮細(xì)胞VEGF的表達(dá)，增加單核細(xì)胞的趨化作用加重平滑肌細(xì)胞增生及血管壁增厚，管腔狹窄及閉塞等引起腎血流量減少，使毛細(xì)血管袢及管周毛細(xì)血管數(shù)量增加，毛細(xì)血管球通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分在內(nèi)皮細(xì)胞外堆積，促進(jìn)炎細(xì)胞在間質(zhì)的浸潤(rùn)，導(dǎo)致腎臟纖維化［13］。Kang等［14］在5／6腎切除大鼠慢性腎衰模型中觀察到早期VEGF明顯增加，隨后隨著腎小球VEGF表達(dá)下降，腎小球毛細(xì)血管損傷越重，腎小球硬化程度也越重。最近有研究報(bào)道VEGF可促進(jìn)糖尿病小鼠腎小球新生血管生成，VEGF表達(dá)上調(diào)與糖尿病腎臟病變密切相關(guān)［15］。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，TGF－β1作用48h后CTGF及VEGF表達(dá)明顯增加，說(shuō)明早期CTGF、VEGF加重了TGF－β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。TGF－β1及FK506共同作用48h檢測(cè)到CTGF、VEGF mRNA均明顯下調(diào)，說(shuō)明在TGF－β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的早期FK506下調(diào)CTGF、VEGF表達(dá)，抑制了腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，且呈劑量依賴性。隨著TGF－β1作用時(shí)間的延長(zhǎng)，在慢性腎功能損傷的后期CTGF及VEGF的變化，及FK506對(duì)其的作用，在今后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)進(jìn)一步探討。

綜上所述，F(xiàn)K506可以抑制TGF－β1介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞致纖維化作用，其作用可能為下調(diào)轉(zhuǎn)分化早期CTGF及VEGF的表達(dá)，保護(hù)腎組織血管床，維持腎小管上皮細(xì)胞正常的功能，為FK506臨床上早期應(yīng)用于慢性腎纖維化的防治提供了一定的理論依據(jù)。

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Effects of Tacrolimus on transdifferentiation and CTGF，VEGF early expression of human renal tubular epithelial cells

Min Yali，Zhao Donghui，Yu Qian
（Department of Nephrology，F(xiàn)irst People′s Hospital of Guiyang City，Guiyang，Guizhou550004，China）

ObjectiveTo explore different doses of tacrolimus（FK506）to renal tubular epithelial cells（HKC）transdifferentiation and its early action on connective tissue growth factor（CTGF），vascular endothelialgrowth factor（VEGF）expressing change.MethodsThe human kidney cells（HKC）were cultured for 48hours in different conditions：（1）Serum free as control，（2）Treated with TGF－β1（8ng／mL）；（3）Treated with FK506at different concentration（10，30，60ng／mL）；（4）Treated with FK506at different concentration（10，30，60ng／mL）plus TGF－β1（ng／mL）.The expression ofα－SMA was assessed with RT－PCR，The expression of CTGF，VEGF was assessed with RT－PCR and immunohistochemistry after 48hours.ResultsCompared with the control group，The expression of CTGF，VEGF andα－SMA mRNA was markedly increased in HCK cultured with TGF－β1group（P＜0.05），which were suppressed significantly in HKC cultured with TGF－β1plus FK506group（P＜0.05）.ConclusionThe inhibition of FK506on transdifferentiation of tubular epithelial cells may be related to the down－regulation of VEGF，CTGF.

tacrolimus；kidney tubules；cell transdifferentiation；vascular endothelial growth factors；connective tissue growth factor

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.32.019

A

1671－8348（2012）32－3401－03

2012－04－07

2012－08－13）

·基礎(chǔ)研究·