4－羥基壬烯醛在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達(dá)＊

謝 姝，周從陽，李 凡，湯旭惠

（1.江西省人民醫(yī)院急診科，南昌330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，南昌330006）

4－羥基壬烯醛在百草枯中毒大鼠肺組織中的表達(dá)＊

謝 姝1，周從陽2△，李 凡1，湯旭惠1

（1.江西省人民醫(yī)院急診科，南昌330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，南昌330006）

目的觀察百草枯（PQ）中毒大鼠肺組織中4－羥基壬烯醛（4－HNE）的表達(dá)。方法將48只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為A、B兩組，每組24只。B組PQ灌胃（80mg／kg）染毒建立SD大鼠肺損傷模型，A組等量生理鹽水灌胃。灌胃后12、24、48、72h觀察兩組大鼠肺組織病理改變及檢測肺組織中4－HNE表達(dá)。結(jié)果肺組織的病理變化：A組無明顯變化；B組肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，伴彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷，肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤。4－HNE在肺組織中的表達(dá)：B組明顯高于A組（P＜0.01）。結(jié)論P(yáng)Q中毒時(shí)4－HNE表達(dá)增強(qiáng)，4－HNE可能為PQ中毒大鼠的肺損傷主要標(biāo)志之一。

百草枯；4－羥基壬烯醛；SD大鼠

百草枯（paraquat，PQ）是一種廣泛應(yīng)用的高效除草劑，口服吸收快，對(duì)人、畜有極高的毒性［1］。PQ進(jìn)入人體后可致多器官出現(xiàn)損傷，其中毒的特征性改變是早期的急性肺損傷和晚期的肺纖維化［2］?；颊叨嗨烙诤粑ソ撸∷缆矢哌_(dá)85%以上［3］。目前認(rèn)為其主要中毒機(jī)制為氧化損傷。為進(jìn)一步探明其中毒機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制大鼠PQ急性中毒模型，觀察PQ中毒后肺組織中4－羥基壬烯醛（4－HNE）的表達(dá)，為進(jìn)一步探明PQ中毒機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SD大鼠48只，體質(zhì)量（220±40）g，雌雄不限，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，分為兩組：對(duì)照組（A組），PQ染毒組（B組），每組24只。實(shí)驗(yàn)參照謝仰民等［4］PQ染毒法建立急性肺損傷模型。B組PQ 80mg／kg一次性灌胃染毒，A組等量無菌生理鹽水灌胃。于染毒12、24、48、72h4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別取 A、B組各6只，大鼠腹腔注射10%水合氯醛3mL／kg麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死。

1.2 觀察指標(biāo) 觀察大鼠肺組織病理改變：按預(yù)定時(shí)間處死大鼠，肉眼觀察大鼠肺組織，并取左肺下葉予10%甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行肺組織病理性觀察。觀察大鼠肺組織4－HNE表達(dá)：按預(yù)定時(shí)間處死大鼠，取左肺下葉予10%甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行免疫組化觀察肺組織4－HNE的表達(dá)。

1.3 試劑 主要試劑為20%PQ水劑（上海先正達(dá)公司）。一抗：兔抗大鼠4－HNE多克隆抗體（美國阿爾法診斷公司）。二抗：聚合HRP標(biāo)記抗兔（武漢博士德公司）。免疫組化酶底物顯色劑：DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。復(fù)染劑：蘇木素（珠海貝索生物技術(shù)有限公司）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)，比較各組差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 染毒72h無大鼠死亡。A組大鼠全部活動(dòng)敏捷，進(jìn)食、進(jìn)水正常，呼吸正常，毛發(fā)光潔。B組大鼠多在染毒1～2h內(nèi)即出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)。具體表現(xiàn)為進(jìn)食、進(jìn)水量明顯減少或不進(jìn)食進(jìn)水，精神差，反應(yīng)遲鈍，呼吸頻率加快，活動(dòng)少，靜伏，易捕捉，毛發(fā)蓬松，口唇發(fā)紺，少數(shù)從口鼻流出血性泡沫狀分泌物。并在染毒24～72h表現(xiàn)最明顯。

2.2 兩組大鼠肺組織4－HNE表達(dá)情況 A組大鼠不表達(dá)或微量表達(dá)。B組大鼠在中毒后的12h表達(dá)即開始增多，48h達(dá)高峰，72h表達(dá)仍高，但較48h下降。與A組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1，封2圖1。

2.3 兩組大鼠肺組織病理改變 A組各時(shí)間點(diǎn)比較均無明顯差異，肉眼見肺組織回縮良好，呈均勻粉紅色，胸腔未見滲出液。光鏡下（OLYMPUS BX40型顯微鏡）見肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡腔內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤，有少許紅細(xì)胞。B組肉眼見肺組織回縮不良，體積明顯增大，可見大片狀出血；光鏡下見染毒12h后肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間隙增寬，血漿蛋白質(zhì)沉積，氣管和血管周圍不同程度水腫，伴彌漫性肺出血，肺泡腔塌陷，部分有透明膜形成，肺泡腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡上皮細(xì)胞退行性變，并隨時(shí)間的推移而加重。見封2圖2。

表1 肺組織中4－HNE表達(dá)變化±s，n＝24）

表1 肺組織中4－HNE表達(dá)變化±s，n＝24）

＃：P＜0.01，與 A組比較。

組別12h 24h 48h 72h A 組 7.00±1.549 7.67±1.862 7.00±1.414 7.33±1.966 B組 203.33±21.556＃ 418.33±43.228＃ 908.17±46.769＃ 801.50±47.247＃

3 討 論

PQ作為一種除草劑，近年來應(yīng)用廣泛，隨之而來的中毒事件日趨增多。PQ中毒可導(dǎo)致全身多器官受損，其致病機(jī)制有多方面。研究表明PQ主要中毒機(jī)制是對(duì)機(jī)體氧化－還原系統(tǒng)的破壞和細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［5］。其中核因子－κB在急性損傷中起一定作用［6］。也有研究發(fā)現(xiàn)PQ中毒大鼠腎組織Livin蛋白及Caspase 3表達(dá)增加，從而推測細(xì)胞凋亡參與了PQ中毒后腎損傷的過程［7］。肺是PQ中毒的主要靶器官，早期可發(fā)生急性肺損傷，晚期則出現(xiàn)肺纖維化［8］。研究發(fā)現(xiàn)，PQ進(jìn)入機(jī)體后被肺泡上皮2型細(xì)胞、1型細(xì)胞和氣管的Clara細(xì)胞主動(dòng)攝取到細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過還原型輔酶Ⅱ（NADPH）還原形成自由基，然后與分子氧反應(yīng)生成聯(lián)吡啶陽離子和超氧陰離子，后者歧化形成H2O2，再在Fe2＋作用下形成高活性自由基如OH－，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起組織細(xì)胞尤其是肺組織的氧化性損傷。同時(shí)，NADPH的大量消耗，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)許多需要NADPH參與的生化反應(yīng)無法進(jìn)行，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷［9－10］。

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)主要分解為醛基產(chǎn)物，后者能與體內(nèi)的許多帶氨基、巰基官能團(tuán)的物質(zhì)如蛋白質(zhì)、氨基酸、磷脂、DNA、膠原纖維、彈性纖維等發(fā)生反應(yīng)，降低其功能，干擾細(xì)胞的正常功能活動(dòng)，損傷細(xì)胞組分而致病。醛基產(chǎn)物中最主要的就是4－HNE和丙二醛（MDA）［11］。目前關(guān)于百草枯中毒后機(jī)體MDA含量變化的研究很多，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PQ染毒后大鼠血清中 MDA含量顯著高于對(duì)照組［12］。宋愛麗［13］救治72例PQ中毒患者發(fā)現(xiàn)其血清中MDA含量增加，以24～48h最明顯。有報(bào)道新生小鼠缺血缺氧后腦組織4－HNE表達(dá)升高［14］。目前文獻(xiàn)報(bào)道4－HNE在肺部疾病的發(fā)生發(fā)展還很少。尤其4－HNE在PQ中毒后機(jī)體損傷中的研究未見報(bào)道。4－HNE來源于ω6多不飽和脂肪酸，研究發(fā)現(xiàn)9（S）氫化過氧十八碳烯酸［9（S）－HPODE］通過3個(gè)步驟降解形成 HNE［15］。哺乳動(dòng)物生理?xiàng)l件下主要通過谷胱甘肽直接和4－HNE反應(yīng)形成復(fù)合物而排出體外。4－HNE對(duì)機(jī)體損害與其濃度有關(guān)，100μmol／L以上能導(dǎo)致急性的細(xì)胞毒性反應(yīng)而加速細(xì)胞死亡，1～20 μmol／L范圍內(nèi)時(shí)能抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成、激發(fā)磷脂酶A2、抑制c－myc表達(dá)，而低于0.1μmol／L時(shí)，對(duì)生物體具有生理意義。故4－HNE含量的變化可以反映機(jī)體清除自由基和抗氧化損傷的能力。近年來有人通過用4－HNE刺激支氣管上皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)4－HNE可通過激活ERK1／2傳導(dǎo)路徑來增強(qiáng)磷酸化，進(jìn)而影響下游轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生一系列生物活性產(chǎn)物，引起炎性改變［16］。還有研究發(fā)現(xiàn)吸煙會(huì)引起大鼠氣道上皮細(xì)胞4－HNE表達(dá)增加，且隨吸煙時(shí)間延長而表達(dá)水平升高［17］。于亮等［18］研究還發(fā)現(xiàn)紅霉素、銀杏內(nèi)酯B能減少4－HNE引起的支氣管上皮細(xì)胞IL－8的合成，從而減輕炎性反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過PQ一次性灌胃大鼠，成功復(fù)制了PQ中毒大鼠肺損傷模型，觀察到與對(duì)照組相比，PQ染毒組大鼠肺組織4－HNE表達(dá)明顯增強(qiáng)，12h即開始，48h達(dá)高峰，表明PQ中毒引起肺損傷的同時(shí)可誘導(dǎo)4－HNE的表達(dá)增強(qiáng)。關(guān)于有效減輕4－HNE引起的機(jī)體損傷的治療措施目前報(bào)道較少，仍需進(jìn)一步研究。

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The expression of 4－h(huán)ydroxynonenal in lungs of paraquat－intoxicated rats＊

Xie Shu1，Zhou Congyang2△，Li Fan1，Tang Xuhui1
（1.Department of Emergency，Provincial Peope′s Hospital of Jiangxi，Nanchang，Jiangxi 330006，China；2.Department of Emergency，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

ObjectiveTo investigate the 4－h(huán)ydroxynonenal（4－HNE）expression changes in lungs of paraquat（PQ）－intoxicated rates.MethodsForty－eight healthy Sprague－Dawley rats were randomly divided into two groups：group A and group B，with 24 rats in each group.The model of lung injury was established by intragastric PQ（80mg／kg）administration in group B，and same quantity of normal saline was administered intragastrically in group A.Pathological changes in lung tissue were observed in 12，24，48and 72hours after treatment.The pathological changes and the expression of 4－HNE in lung tissue were detected.ResultsThere was no significant change in A group.The pathological changes，including alveolar capillary expansion，diffuse alveolar hemorrhage and alveolar inflammation cell infiltration，were found in lungs of rats in group B.Compared with group A，the expression of 4－HNE in lung tissue significantly increased in group B（P＜0.01）.ConclusionThe expression of 4－HNE increased in PQ intoxicated rats.4－HNE may play an important role in rats′lung injury induced by PQ.

paraquat；4－h(huán)ydroxynonenal；SD rats

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.32.016

A

1671－8348（2012）32－3394－02

江西省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)課題（20111015）?！?/p>

：Tel：13979136969；E－mail：zhoucongyang＠sina.com。。

2012－03－29

2012－07－21）

·基礎(chǔ)研究·