弓形蟲與瘧原蟲入侵引起宿主細(xì)胞骨架重組相關(guān)GTP酶不同定位的觀察＊

陳艾媛，娜仁花，彭鴻娟，趙 亞

弓形蟲（Toxopl asma gondii）和瘧原蟲（Pl asmodiu m spp）的分類地位均屬于頂復(fù)門（Phyl u m Apico mplexa），孢子綱（Class Sporozoea），真球蟲目（Or der Eucoccidiida）［1］。頂復(fù)門原蟲都是通過與其質(zhì)膜相連的肌動(dòng)蛋白－肌球蛋白馬達(dá)，以主動(dòng)入侵的方式侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，而不是被宿主細(xì)胞所攝取或吞噬［2］。兩種原蟲都以納蟲泡的形式在宿主細(xì)胞內(nèi)寄生并增殖，但是弓形蟲、瘧原蟲與宿主細(xì)胞之間的相互作用大部分并不十分清楚，兩者入侵細(xì)胞及納蟲泡膜形成的過程也各有不同的特點(diǎn)。

細(xì)菌、病毒等病原入侵宿主細(xì)胞后都伴隨有宿主細(xì)胞骨架重組的過程［3］。頂復(fù)門的原蟲包括隱孢子蟲（Cr yptosporidiu m par vu m）、弓形蟲、瘧原蟲入侵宿主細(xì)胞后都有引發(fā)宿主細(xì)胞骨架重組的現(xiàn)象：隱孢子蟲感染宿主細(xì)胞時(shí)誘導(dǎo)宿主肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)形成片狀結(jié)構(gòu)，將蟲體與宿主細(xì)胞質(zhì)分隔開來，從而形成一個(gè)細(xì)胞內(nèi)胞質(zhì)外的小室，并在小室中進(jìn)行增殖［4］；弓形蟲速殖子和伯氏瘧原蟲裂殖子入侵宿主細(xì)胞后在“運(yùn)動(dòng)連接（moving j unction）”處形成一個(gè)宿主細(xì)胞F－肌動(dòng)蛋白環(huán)，因而推測弓形蟲與瘧原蟲的入侵過程需要宿主細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的極化［2］；弓形蟲的入侵激活宿主細(xì)胞微管和微絲等細(xì)胞骨架元件的重組［5］，而在感染的晚期，弓形蟲啟用宿主細(xì)胞的微管形成管道結(jié)構(gòu)將宿主細(xì)胞器組分運(yùn)輸?shù)郊{蟲泡膜上［6］；瘧原蟲感染紅細(xì)胞后，向紅細(xì)胞的胞質(zhì)中分泌蟲體蛋白，調(diào)控紅細(xì)胞骨架的重組［7－9］。

Rho GTP酶屬于Ras超家族的成員，其分子量一般在20～30 k D。Ras家族成員眾多，在哺乳動(dòng)物中至少由14個(gè)亞族組成，其中最具代表性的為Rho（Ras ho mologous member）、Rac （ras－related C3 bot ulinu m toxin sub－strate）和 Cdc42 （cell division cycle 42）3個(gè)亞族。Rho GTP酶廣泛地調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，許多調(diào)節(jié)是通過控制肌動(dòng)蛋白極性來實(shí)現(xiàn)的。Rho GTP酶家族調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白骨架，微管動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞極性和運(yùn)動(dòng)性，小泡運(yùn)輸路徑以及細(xì)胞吸附、移動(dòng)、增殖與生存［10－13］。在瘧原蟲入侵紅細(xì)胞時(shí)，Rac GTP酶是紅細(xì)胞骨架重組的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)因子［14］。肌動(dòng)蛋白低聚體是紅細(xì)胞骨架重要的結(jié)構(gòu)組成部分，Rac1和Rac2調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)，在造血細(xì)胞中有許多重疊的和獨(dú)特的功能［14］。Rho A被發(fā)現(xiàn)存在于紅細(xì)胞的胞質(zhì)和膜上，而且高度親合性地結(jié)合于紅細(xì)胞膜的胞質(zhì)面上［15］。而在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時(shí)，Rho GTP酶調(diào)控宿主細(xì)胞骨架的重組卻未見文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。

為了解宿主細(xì)胞Rho GTP酶在弓形蟲與瘧原蟲這兩種原蟲入侵過程中對(duì)宿主細(xì)胞骨架重組所起的調(diào)控作用，本研究選取Rho GTP酶家族中的Rho A和Rac1作為靶標(biāo)蛋白，利用細(xì)胞免疫熒光的方法來檢測弓形蟲和瘧原蟲入侵宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞Rho GTP酶在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細(xì)胞株、蟲株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人呼吸道上皮細(xì)胞16－HBE購自上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司。SPF級(jí)KM鼠（18～22 g雌性鼠）購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。弓形蟲RH株為本實(shí)驗(yàn)室保存，接種于SPF級(jí)KM鼠腹腔中傳代。惡性瘧原蟲云南地理株由第四軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室保存。

1．1．2 主要試劑 Trit on X－100、DAPI購于sigma公司；兔抗人Rac1和兔抗人Rho A單克隆抗體均購于 Cell Signaling公司；二抗 goat anti－rabbit Ig GFITC購于SANTA CRUZ公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)胞爬片及涂片的制備

1．2．1．1 16－HBE細(xì)胞爬片制備及弓形蟲感染放置4片蓋玻片于六孔板內(nèi)其中四孔，將16－HBE細(xì)胞平均分到此四孔中，用DMEM＋10%NBS培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率達(dá)95%～100%，細(xì)胞長在蓋玻片上制備細(xì)胞爬片，方便下一步的免疫熒光實(shí)驗(yàn)操作與觀察。從KM鼠腹腔中抽取弓形蟲RH株速殖子，3 000×g離心5 min后棄掉上清液，加入4 m L DMEM完全培養(yǎng)基重懸蟲體，混勻后均勻加入四孔16－HBE細(xì)胞爬片的培養(yǎng)孔中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中侵染2 h。吸掉細(xì)胞培養(yǎng)基上清，并用PBS洗滌細(xì)胞3次，洗去未侵染的弓形蟲速殖子。

1．2．1．2 惡性瘧原蟲體外同步化培養(yǎng)和血涂片制備 惡性瘧原蟲復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)參照Trager等的方法［16］進(jìn)行。簡述如下：以RPMI1640為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中含有25 mmol／L HEPES，0．2%Na HCO和10%人血清，紅細(xì)胞壓積2%～5%，在5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)。每天換液一次、每隔3天添加一次新鮮人紅細(xì)胞。選擇瘧原蟲環(huán)狀體較多的發(fā)育階段開始同步化培養(yǎng)，待瘧原蟲同步化至成熟裂殖體為主且出現(xiàn)部分早期環(huán)狀體階段時(shí)，吸取適量懸浮紅細(xì)胞，離心，留取適量上清，重懸紅細(xì)胞制作薄血片，同時(shí)制作正常紅細(xì)胞薄血片為陰性對(duì)照。血片自然晾干，4℃預(yù)冷無水乙醇固定10 min，冷風(fēng)吹干，PAP筆劃分實(shí)驗(yàn)區(qū)域待用。

1．2．2 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 室溫條件下用多聚甲醛固定細(xì)胞爬片或紅細(xì)胞涂片10 min，PBS振蕩洗滌（5 min×3次），透化液（0．5%Tritonx－100，PBS稀釋）500μL覆蓋細(xì)胞后室溫靜置10 min。PBS振蕩洗滌（5 min×3次），封閉液（0．1%Triton X－100，用新生牛血清稀釋）500μL覆蓋細(xì)胞并在37℃下孵育1 h。棄去封閉液，加入500μL一抗（封閉液稀釋，稀釋度1∶500），37℃孵育3 h。棄一抗，PBS振蕩洗滌（5 min×3次）。加入500μL FITC標(biāo)記的二抗 （封閉液稀釋，稀釋度1∶300）37℃條件下避光孵育1 h。在陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞不用一抗孵育，僅以FITC標(biāo)記的二抗（封閉液稀釋，稀釋度1∶300）孵育。以下過程均在避光條件下進(jìn)行，PBS振蕩洗滌（5 min×3次），10 n mol／L DAPI染色5 min，PBS振蕩洗滌（5 min×3次），用雙蒸水洗去玻片上的鹽分。將玻片避光置于濾紙上風(fēng)干，封片并在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

在熒光顯微鏡下用FITC濾光片觀察可見，經(jīng)抗人Rac1和Rho A單抗及FITC標(biāo)記的二抗孵育后的16－HBE細(xì)胞內(nèi)，在弓形蟲納蟲泡膜上有熒光的豐度聚集（見圖1－A和圖1－C，黃色箭頭所示）；陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，只用FITC標(biāo)記的二抗與16－HBE細(xì)胞內(nèi)孵育，在弓形蟲納蟲泡膜上沒有熒光的豐度聚集（見圖1－E）；而在未被侵染的16－HBE細(xì)胞中，只見Rho A和Rac1 GTP酶在細(xì)胞質(zhì)中的均勻分布（見圖1－B和圖1－D）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞后，出現(xiàn)了宿主細(xì)胞的Rho A和Rac1 GTP酶聚集在弓形蟲納蟲泡膜上的現(xiàn)象。然而，在用抗人Rac1和Rho A單抗孵育后的被惡性瘧原蟲侵染的紅細(xì)胞中，瘧原蟲納蟲泡上沒有看到熒光的聚集（見圖2－A和圖2－C，黃色箭頭所示）；而在未被侵染的紅細(xì)胞中只見Rho A和Rac1 GTP酶在紅細(xì)胞中均勻分布（見圖2－B和圖2－D）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在被惡性瘧原蟲感染的紅細(xì)胞內(nèi)的納蟲泡膜上未出現(xiàn)Rho A和Rac1 GTP酶聚集的現(xiàn)象。

圖1 弓形蟲RH株速殖子侵染16－HBE細(xì)胞后抗Rho A、Rac1單抗免疫熒光檢測結(jié)果Fig．1 The immunofluorescence detection with anti－RhoA and anti－Rac1 mAb of 16－HBE cells infected with T．gondii RH tachyzoites

在綠色熒光顯微鏡下可見宿主細(xì)胞的Rho A和 Rac1 GTP酶在弓形蟲納蟲泡膜上的高豐度聚集（Fig 1－A，和 Fig 1－C，黃色箭頭所示），而在陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)組中，當(dāng)細(xì)胞只與FITC標(biāo)記的Ig G二抗孵育時(shí)，熒光沒有在納蟲泡膜上聚集的現(xiàn)象（Fig 1－B，和 Fig 1－D）。

在綠色熒光顯微鏡下可見紅細(xì)胞的Rho A和Rac1 GTP酶在惡性瘧原蟲（包括環(huán)狀體、未成熟裂殖體和成熟裂殖體等階段）納蟲泡膜上均沒有聚集（Fig 2－A，和 Fig 2－C，黃色箭頭所示），而在未被侵染的紅細(xì)胞中只見Rho A和Rac1 GTP酶在紅細(xì)胞中均勻分布（Fig 2－B，和 Fig 2－D）。

圖2 惡性瘧原蟲裂殖子侵染人紅細(xì)胞后抗Rho A、Rac1單抗免疫熒光檢測結(jié)果Fig．2 The i mmunofluorescence detection with anti－Rho A and anti－Rac1 mAb of human erythrocytes infected with Plasmodium f alcipar um mer ozoites

3 討 論

雖然弓形蟲與瘧原蟲均屬于頂復(fù)門的細(xì)胞內(nèi)原蟲，并以納蟲泡的形式在宿主細(xì)胞內(nèi)寄生并增殖，但是兩者入侵細(xì)胞及納蟲泡膜形成的過程卻各有不同的特點(diǎn)。弓形蟲對(duì)宿主細(xì)胞無特異的選擇性，幾乎可以感染所有的有核細(xì)胞。弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的過程是主動(dòng)入侵，弓形蟲以滑動(dòng)的運(yùn)動(dòng)方式靠近宿主細(xì)胞膜，其類錐體緊密粘附于宿主細(xì)胞膜并向前推進(jìn)，弓形蟲棒狀體與前端表膜融合后釋放調(diào)控蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表面形成絲狀偽足和通道輔助其入侵，同時(shí)宿主細(xì)胞膜向內(nèi)凹陷，蟲體通過類錐體端進(jìn)入細(xì)胞［17］。入侵部位的宿主細(xì)胞膜形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)壓縮包圍蟲體，入侵完成后宿主細(xì)胞膜封閉，納蟲泡形成［18－20］。在與宿主細(xì)胞的吸附過程中，弓形蟲分泌的微粒體蛋白和棒狀體頸蛋白形成的運(yùn)動(dòng)連接（moving junction，MJ）［21－22］是弓形蟲吸附于宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，且具有從納蟲泡膜中篩選宿主細(xì)胞膜組分的功能［23］。一些宿主細(xì)胞膜組分如與膜筏（membrane raft）、細(xì)胞骨架定位及分子多聚體形成相關(guān)的跨膜蛋白等，被迅速清除并在成熟的納蟲泡膜中消失，這些組分的排除可避免納蟲泡被內(nèi)膜系統(tǒng)融合［24］，但許多膜脂卻被保留下來。納蟲泡外表面還與宿主細(xì)胞的細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)緊密結(jié)合，這些細(xì)胞器的膜組分為納蟲泡的生長擴(kuò)大提供膜組分來源［18－19］。納蟲泡膜的組分中，大部分來源于宿主細(xì)胞膜，少數(shù)來源于宿主細(xì)胞質(zhì)，還包括弓形蟲分泌的棒狀體蛋白、微粒體蛋白、致密顆粒蛋白［18－19］。由此，弓形蟲在入侵后在宿主細(xì)胞內(nèi)形成了一個(gè)非融合小室—納蟲泡包圍著蟲體，來抵抗宿主細(xì)胞內(nèi)涵體的酸化及溶酶體的融合作用，即防止被宿主細(xì)胞清除。

瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞則具有高度的宿主特異性，這是因?yàn)榀懺x是以配體－受體結(jié)合的方式來識(shí)別紅細(xì)胞的［25］。瘧原蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞的過程開始于裂殖子與紅細(xì)胞表面之間的微弱的吸附作用，是通過尚未鑒定的原蟲配體與紅細(xì)胞受體之間的相互作用，接著裂殖子的類錐體頂端與紅細(xì)胞表面緊密結(jié)合［26－27］。裂殖子觸發(fā)了與紅細(xì)胞之間“連接（junction）”的形成，該連接在電子顯微鏡下顯示為電子致密區(qū)，存在于裂殖子類錐體的一端。此外，裂殖子分泌棒狀體蛋白進(jìn)入紅細(xì)胞，可能促進(jìn)入侵的過程［27－29］。裂殖子最終通過原蟲表面蛋白和原蟲的肌動(dòng)蛋白－肌球蛋白馬達(dá)之間的相互作用，隨著該“連接”向紅細(xì)胞內(nèi)的移動(dòng)而進(jìn)入紅細(xì)胞［30］。因此，該“連接”的形成及其與原蟲分子馬達(dá)之間的相互作用是入侵的關(guān)鍵步驟［31－32］。而納蟲泡是由紅細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)而形成，與原蟲進(jìn)入紅細(xì)胞的過程同步完成［29］，在入侵過程結(jié)束的時(shí)候，“連接”部分的電子致密區(qū)成為納蟲泡的一部分包裹著剛?cè)肭值脑x［27］。

從弓形蟲與瘧原蟲入侵宿主細(xì)胞的過程和納蟲泡形成過程來看，兩者都具有很多的相同之處，如在入侵開始時(shí)，弓形蟲速殖子和瘧原蟲裂殖子入侵宿主細(xì)胞都形成一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)——“運(yùn)動(dòng)連接（moving junction）”，并在該連接處形成一個(gè)宿主細(xì)胞F－肌動(dòng)蛋白環(huán)，激活宿主細(xì)胞骨架發(fā)生重組［2］；此外，兩種原蟲納蟲泡膜的組分大部分是來源于宿主細(xì)胞膜，小部分來源于原蟲本身的分泌蛋白，而且還有一些來源于宿主細(xì)胞質(zhì)。

弓形蟲感染宿主細(xì)胞后，在納蟲泡膜上有宿主細(xì)胞Rho A與Rac1 GTP酶的聚集，這兩種宿主細(xì)胞的酶類被納入了弓形蟲的納蟲泡膜上的方式有可能包括以下三種：1、隨同宿主細(xì)胞膜一同被組成到納蟲泡膜上；2、通過擴(kuò)散作用，從宿主細(xì)胞質(zhì)中被組成到納蟲泡膜上；3、來源于與弓形蟲納蟲泡膜緊密結(jié)合且作為納蟲泡擴(kuò)大中主要膜成分來源的宿主細(xì)胞器如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等。

盡管Rho AGTP酶被發(fā)現(xiàn)存在于紅細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜上，而且高度親合性地結(jié)合于紅細(xì)胞膜的胞質(zhì)面上［15］，但是瘧原蟲納蟲胞膜上沒有發(fā)現(xiàn)Rho A和Rac1 GTP酶聚集，這個(gè)現(xiàn)象有可能說明：1、紅細(xì)胞膜上的Rho GTP酶并沒有在納蟲泡形成時(shí)隨著紅細(xì)胞膜被納入到納蟲泡膜上；2、細(xì)胞質(zhì)中的Rho GTP酶也沒有被組成到納蟲泡膜上；3、因?yàn)榧t細(xì)胞內(nèi)沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器，因而也不可能通過膜融合的方式被組成到納蟲泡膜上。

盡管弓形蟲、瘧原蟲的入侵過程需要宿主細(xì)胞骨架發(fā)生重組，而細(xì)胞骨架的重組又是由Rho GTP酶家族所調(diào)控，但是這個(gè)過程的具體細(xì)節(jié)仍是未知。宿主細(xì)胞Rho GTP酶在弓形蟲速殖子與瘧原蟲裂殖子入侵宿主細(xì)胞時(shí)不同的分布現(xiàn)象，顯示這兩種原蟲通過不同的途徑來調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞骨架重組。

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