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    電針對(duì)嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶和VTA腦區(qū)CaMKⅡ含量的影響

    2012-09-25 08:52:20孫遠(yuǎn)征王明明衛(wèi)哲馬俊
    上海針灸雜志 2012年2期
    關(guān)鍵詞:嗎啡迷宮艾灸

    孫遠(yuǎn)征,王明明,衛(wèi)哲,馬俊

    (1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院,哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),哈爾濱 150040)

    電針已成為戒毒的有效治療方法,中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)(MLDS)參與成癮機(jī)制,是與學(xué)習(xí)、記憶、情感及行為學(xué)相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)。藥物成癮可對(duì)成癮者的學(xué)習(xí)記憶能力造成一定損害[1]。研究證實(shí) Ca2+-CaM-CaMK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在嗎啡成癮中起到重要作用[2],本實(shí)驗(yàn)采用水迷宮訓(xùn)練來(lái)觀察電針對(duì)嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶的改善,并從中腦VTA水平檢測(cè)CaMKⅡ的活性,深入研究電針抗嗎啡戒斷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

    雄性SD大鼠48只,體重(190±30)g,清潔級(jí),由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,適應(yīng)性喂養(yǎng) 1星期后隨機(jī)分組,分為生理鹽水對(duì)照組(對(duì)照組),嗎啡戒斷模型組(模型組),電針治療組(電針組),艾灸治療組(艾灸組),共4組,每組12只。

    1.2 試劑和儀器

    鹽酸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠),鹽酸納洛酮(成都倍特藥業(yè)有限公司),戊二醛(上海生物工程有限公司),多聚甲醛(分析純,上海溶劑廠),免疫組化檢測(cè)試劑盒(PV-6001)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);KWD808Ⅱ脈沖治療儀,Morris水迷宮。

    1.3 造模

    參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]進(jìn)行造模,除對(duì)照組外,每組采用逐日遞增法連續(xù)5 d背部皮下注射嗎啡,建立嗎啡依賴(lài)大鼠模型,每日 2次(8 Am、4 Pm),每日劑量為 20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、50 mg/kg。末次注射嗎啡后3 h腹腔注射納洛酮(3 mg/kg)快速戒斷,立即將大鼠置于 3000 mL大燒杯中,記錄 10 min內(nèi)大鼠的濕狗樣抖動(dòng)、站立、扭體、洗臉等次數(shù)以及齒顫、上瞼下垂、激惹和體重下降等不可數(shù)戒斷癥狀反應(yīng),戒斷癥狀反應(yīng)參照 Maldonade[4]的方法,根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,與已建立的嗎啡戒斷大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)比較,確定模型建立成功。

    1.4 實(shí)驗(yàn)處理

    上述戒斷模型建立后次日進(jìn)行處理,穴位按照林文注《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]取大鼠百會(huì)、大椎,雙側(cè)腎俞、三陰交及足三里穴。

    電針組給予大鼠捆綁固定,針刺上述穴位,連接電針治療儀,采用疏密波,頻率 2/100 Hz,連接足三里及三陰交,以大鼠的下肢輕微抖動(dòng)為度,每次 15 min,每日1次,連續(xù)治療6 d。

    其余三組在相同時(shí)間相同方法捆綁固定,艾灸組在上述穴位給予艾條灸法治療。

    1.5 Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶

    參考相關(guān)文獻(xiàn)[6],水迷宮測(cè)試分為兩個(gè)階段,第一階段是從治療的第1、2日進(jìn)行水迷宮定位航行訓(xùn)練,每日4次,實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于站臺(tái)上適應(yīng)10 s,隨機(jī)將大鼠從不同象限置入池內(nèi),登上站臺(tái)5 s后終止記錄,最長(zhǎng)記錄 60 s,60 s內(nèi)不能上臺(tái)的讓其登上站臺(tái)適應(yīng)10 s,第3、4、5日開(kāi)始測(cè)試,測(cè)量各組平臺(tái)逃避潛伏期以評(píng)判大鼠的空間學(xué)習(xí)能力;第二階段是治療第6日將平臺(tái)撤除進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),將大鼠從遠(yuǎn)離靶象限入水,記錄60 s內(nèi)跨越平臺(tái)次數(shù)以評(píng)判大鼠的空間記憶能力。

    1.6 CaMKⅡ含量的測(cè)定

    實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組大鼠立即麻醉,左心室插管灌入生理鹽水、4℃的 4%多聚甲醛灌注固定。斷頭取腦置于4%多聚甲醛中進(jìn)一步固定,石蠟包埋后行VTA腦切片,片厚6 mm。采用免疫組化PV二步法,按照試劑盒步驟操作。最后采用圖像分析系統(tǒng)對(duì)切片進(jìn)行攝片,測(cè)定VTA腦區(qū)CaMKⅡ的平均光密度,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠嗎啡戒斷癥狀評(píng)分比較

    除對(duì)照組外,其余各組大鼠均出現(xiàn)濕狗樣抖動(dòng)、站立、跳躍、洗臉、齒顫、上瞼下垂、激惹等癥狀,并伴有不同程度的體重下降。而對(duì)照組無(wú)明顯戒斷反應(yīng),與之比較,模型組、電針組及艾灸組有明顯戒斷反應(yīng)(P<0.01),表示大鼠嗎啡戒斷模型建立成功。詳見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠嗎啡戒斷癥狀評(píng)分比較 (x ±s,分)

    2.2 各組大鼠Morris水迷宮的測(cè)試結(jié)果比較

    在定位航行實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組、電針組及艾灸組的平均潛伏期與模型組比較明顯縮短(P<0.01),提示其空間學(xué)習(xí)能力明顯改善;電針組和艾灸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示電針組優(yōu)于艾灸組。詳見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠平均潛伏期的比較 (x±s,s)

    在空間探索實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組和電針組與模型組比較,穿臺(tái)次數(shù)均顯著增加(P<0.01),艾灸組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),電針組和艾灸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示空間記憶改善,電針組療效明顯。詳見(jiàn)表3。

    表3 各組大鼠總共穿臺(tái)次數(shù)的比較 (x ±s,次)

    2.3 各組大鼠CaMKⅡ的免疫組化結(jié)果比較

    對(duì)照組、電針組及艾灸組CaMKⅡ的平均光密度值均明顯高于模型組(P<0.01),提示在治療后VTA腦區(qū)內(nèi) CaMKⅡ的活性明顯增加;電針組與艾灸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示電針組優(yōu)于艾灸組。詳見(jiàn)表4。

    表4 各組大鼠海馬區(qū)CaMKⅡ的含量比較 (x±s,mg/L)

    3 討論

    嗎啡成癮被認(rèn)為與學(xué)習(xí)記憶有關(guān),成癮本身是一種記憶的同時(shí)又影響另一種記憶過(guò)程[7]。曾燕等[1]證實(shí)電針對(duì)嗎啡戒斷后大鼠的學(xué)習(xí)記憶有明顯恢復(fù)作用,然而是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)改善損害后學(xué)習(xí)記憶功能尚不十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立嗎啡戒斷模型,給予電針治療、定位航行和空間探索訓(xùn)練以及中腦VTA腦區(qū)的活性表達(dá)檢測(cè)。有研究證明在采用Morris水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)中采用第1次從遠(yuǎn)離靶象限入水的成績(jī)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)檢測(cè)大鼠的空間記憶能力得到比較合理的結(jié)果[8]。

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿片類(lèi)成癮機(jī)制是煙毒內(nèi)蘊(yùn)、各臟腑氣血陰陽(yáng)失衡,主要與肝、腎、脾有關(guān)[9,10]。選取百會(huì)、大椎、腎俞、足三里、三陰交各穴共同調(diào)節(jié)各臟腑的陰陽(yáng)平衡。MLDS是一種主要涉及多巴胺、阿片肽、CaMK等不同遞質(zhì)及受體的系統(tǒng)。阿片類(lèi)物質(zhì)作用于該系統(tǒng),使其各功能和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致用藥者產(chǎn)生強(qiáng)迫性用藥和渴求狀態(tài),因此認(rèn)為成癮是一種慢性復(fù)發(fā)性腦病[11],針刺是一種有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的刺激形式,電針戒斷安全、可靠。研究證明2 Hz頻率電針可以促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放腦啡肽,100 Hz頻率釋放強(qiáng)啡肽,CaMKⅡ是突觸后致密物的主要成分,長(zhǎng)期給予嗎啡,中腦和海馬內(nèi) CaMKⅡ活性和激酶含量明顯下降[12],嗎啡成癮影響學(xué)習(xí)記憶可能是通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度,降低依賴(lài)于 Ca2+的 CaMKⅡ蛋白活性而損害記憶,有相關(guān)海馬內(nèi) Ca2+-CaMK與嗎啡戒斷后學(xué)習(xí)記憶影響的研究,本實(shí)驗(yàn)從中腦VTA水平觀察CaMKⅡ的含量表達(dá)與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系。

    由于關(guān)于針灸對(duì)嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的研究尚處于初級(jí)階段,隨著研究的進(jìn)展,可以在大樣本實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明阿片類(lèi)物質(zhì)成癮的中樞機(jī)制,通過(guò)阻斷與成癮有關(guān)的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程來(lái)治療成癮以及防止復(fù)吸提供可靠的理論基礎(chǔ)。

    [1] 曾燕,梁勛廠,李熳,等.電針對(duì)嗎啡戒斷大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬 CA3區(qū)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)損害的恢復(fù)作用[J].針刺研究,2004,29(4):245- 251.

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