高產(chǎn)S-腺苷蛋氨酸的釀酒酵母發(fā)酵條件的響應面法優(yōu)化

朱 靖 博, 宋 青 楠, 耿 慧 琴, 許 芹 永

( 1.大連工業(yè)大學 食品學院, 遼寧 大連 116034; 2.大連博邁科技發(fā)展有限公司, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

S-腺苷蛋氨酸(SAM)有“活性甲硫氨酸”之稱,于1953年被Cantoni[1]發(fā)現(xiàn)。SAM作為人體內最重要的甲基供體,在生命活動中,使得許多重要物質如核酸、蛋白質、脂類、碳水化合物等甲基化。SAM還是轉甲基反應、轉硫反應和多胺合成反應的促進劑。目前SAM的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、酶促轉化法、發(fā)酵法?；瘜W合成法產(chǎn)率低,底物價格昂貴,產(chǎn)物易發(fā)生消旋,已經(jīng)很少使用[2]。酶促轉化法是利用SAM合成酶催化L-蛋氨酸和ATP合成SAM[3],由于細胞中SAM合成酶分離純化困難,因此酶促法也無法應用于工業(yè)生產(chǎn)。發(fā)酵法成本低,易于實現(xiàn),是目前工業(yè)化生產(chǎn)的主要手段。國外對發(fā)酵法制備SAM進行了較多的研究[4],并已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。而國內對SAM制備技術的研究起步較晚,發(fā)酵水平遠低于國外。

釀酒酵母具有較強的SAM胞內積累能力,是目前工業(yè)化生產(chǎn)的主要菌株。本文通過對本實驗室保存的釀酒酵母積累SAM能力進行考察,并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,提高了SAM的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

釀酒酵母,菌株編號F2103,大連工業(yè)大學食品發(fā)酵微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

(1)固體培養(yǎng)基(YEPD):葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,瓊脂20 g/L。

(2)種子液培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,校正至pH=6。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,硫酸銨5 g/L,磷酸二氫鉀6 g/L,磷酸氫二鉀3 g/L,硫酸鎂1.5 g/L,L-蛋氨酸1 g/L,校正至pH=6。

1.3 培養(yǎng)條件

種子液制備:挑取一環(huán)菌種,接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于28 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵液制備:將種子液按照10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量為50 mL,在30 ℃,180 r/min 條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。

1.4 分析方法

1.4.1 生物量測定方法

取5 mL發(fā)酵液4 500 r/min離心15 min收集菌體,用去離子水水洗2次,離心收集菌體,105 ℃ 烘干至恒重,稱重。

1.4.2 SAM胞內產(chǎn)量的測定

發(fā)酵液處理:取5 mL發(fā)酵液4 500 r/min離心15 min,收集菌體,按照每克濕菌體加入0.24 mL 乙酸乙酯,0.24 mL水,振蕩破碎30 min,再按照每克濕菌體加入0.56 mL 0.35 mol/L 硫酸振蕩破碎1.5 h,然后將處理液10 000 r/min離心10 min收集上清液,做適當稀釋后進行高效液相色譜檢測。

HPLC檢測條件:色譜柱為C18,流動相為40 mmol/L KH2PO4,2 mmol/L庚烷磺酸鈉+體積分數(shù)18%甲醇-水,體積流量為1 mL/min,進樣量為20 μL,檢測波長為254 nm,柱溫為室溫。

1.4.3 SAM胞內產(chǎn)量的計算

1.5 實驗方法

以SAM胞內產(chǎn)量作為響應值,通過3個步驟進行優(yōu)化。(1)利用PB實驗設計篩選出對SAM胞內產(chǎn)量影響顯著的因素,各因素水平設計見表1。(2)利用最陡爬坡實驗逼近最大響應區(qū)域。(3)利用響應面法中的Box-Behnken設計實驗,通過對實驗數(shù)據(jù)擬合得到二階響應面模型,并最終確定最優(yōu)發(fā)酵條件,并進行驗證實驗。

表1 Plackett-Burman實驗設計與結果(N=12)

2 結果與討論

2.1 PB實驗確定顯著影響因素

本實驗采用PB實驗設計對影響SAM胞內產(chǎn)量的因素進行了篩選,選用N=12的實驗設計對8個因素(發(fā)酵溫度,pH,裝液量,接種量,種齡,L-Met質量濃度,搖床轉速,發(fā)酵時間)進行研究,實驗設計及結果如表1所示。

采用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析(表2),獲得多元一次擬合回歸方程:

w(SAM)=192.98+15.44A-1.22B+

9.23D-21.58E+30.91G-

18.47H+8.83J+33.42K

表2 Plackett-Burman實驗結果的方差分析表

2.2 最陡爬坡實驗

根據(jù)PB實驗結果設計顯著影響因素的最陡爬坡路徑,L-Met質量濃度為正效應,接種量和發(fā)酵時間為負效應,根據(jù)這3個因素效應大小的比例及實驗結果設計其變化方向及步長進行最陡爬坡實驗,結果見表3。由表3可以看出,菌株F2103發(fā)酵產(chǎn)SAM胞內最高產(chǎn)量在第二次實驗附近,故選取中心點為接種量10%,L-Met質量濃度4.0 g/L,發(fā)酵時間54 h。

表3 最陡爬坡實驗結果

2.3 Box-Behnken設計及響應面分析

根據(jù)最陡爬坡實驗,菌株在第二次實驗時進入最大產(chǎn)SAM區(qū)域,確定以接種量10%、L-Met質量濃度4.0 g/L、發(fā)酵時間54 h為中心點,然后對這3個因素進行Box-Behnken設計,實驗中每個因素取3個水平共進行17次實驗,Box-Behnken設計及結果見表4。

表4 Box-Behnken設計表及其結果

Design-Expert對Box-Behnken設計實驗結果進行分析,獲得擬合二次多項式回歸方程:

w(SAM)=285.82-11.13A-6.97B+

12.78C-8.85AB-11.67AC+

17.01BC-39.26A2-26.76B2-

32.50C2。

表5 Box-Behnken設計實驗結果的方差分析表

利用Design-Expert軟件對上述模型進行優(yōu)化處理,確定其發(fā)酵條件:發(fā)酵溫度30 ℃,pH為6.0,裝液量60 mL,接種量10%,種齡24 h,搖床轉速180 r/min,L-Met質量濃度為4.0 g/L,發(fā)酵時間56 h。模型理論預測該條件下SAM胞內產(chǎn)量最大值為288.277 mg/g。

各因素響應曲面圖見圖1～3。

圖1 發(fā)酵時間和接種量對SAM胞內產(chǎn)量影響的響應面圖

Fig.1 Chart on effects of fermentation time and inoculum volume on SAM production

圖2 發(fā)酵時間和L-Met質量濃度對SAM胞內產(chǎn)量影響的響應面圖

Fig.2 Chart on effects of fermentation time and concentration of L-Met on SAM production

圖3 L-Met質量濃度和接種量對SAM胞內產(chǎn)量影響的響應面圖

Fig.3 Chart on effects of concentration of L-Met and inoculum volume on SAM production

2.4 驗證實驗

為了驗證模型的可靠性,在最優(yōu)發(fā)酵條件下進行重復實驗3次,分別得到SAM的胞內產(chǎn)量為286.981,289.470,286.396 mg/g, SAM的胞內產(chǎn)量平均值為287.615 7 mg/g,與預測值288.277 mg/g 非常接近,這表明實驗值和實際值間有很好的擬合性,優(yōu)化模型可靠。

3 結 論

通過3種實驗設計相結合,篩選出對SAM胞內產(chǎn)量影響顯著的3個因素為接種量、L-Met質量濃度和發(fā)酵時間。得到最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30 ℃,pH 6.0,裝液量60 mL,接種量10%,種齡24 h,搖床轉速180 r/min,L-Met 質量濃度為4.0 g/L,發(fā)酵時間56 h。在此基礎上進行發(fā)酵驗證,得到SAM胞內產(chǎn)量287.615 7 mg/g,比優(yōu)化前提高了1.38倍。

[1] CANTONI G L. S-adenosyl-L-methionine:Anewineter-mediate formedenzymatically from L-methionine and adenosinetriphosphate[J]. Biological Chemistry, 1953, 204(1):403-416.

[2] MATOS J R, WONG C H. S-adenosylmethionine:stability and stabilization[J]. Bioorganic Chemistry, 1987, 15(1):71-80.

[3] CANTONI G L. The nature of the active methyl-sonor formed enzymatically from L-methinine and asenosine triphosphate[J]. Journal of American Chemical Society, 1952, 74:2942-2943.

[4] MATOS J R, RAUSHEL F M, WONG C H. S-adenosylmethionine studies on chemical and enzymatic synthesis[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry, 1987, 9(1):39-52.