新型飼料添加劑玉米小肽的制備及腸吸收的初步研究

張曉峰 李鳳玲 邊傳周

(鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南鄭州450011)

肽是由一定數(shù)量的氨基酸通過肽鍵相連而成的有機物，一般把肽鍵中氨基酸數(shù)為2～20個的肽稱為寡肽或小肽，而將肽鏈長度大于20個氨基酸的肽稱為多肽。近代研究表明，蛋白質(zhì)吸收的主要形式不是以氨基酸的形式而是以小肽的形式完整吸收，小肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)具有速度快、耗能低和不易飽和等特點，以肽的形式吸收的氨基酸強度要比以游離氨基酸混合物吸收的強度高出70%～80%，其可以直接通過小腸壁進入血液，進而影響動物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝[1]。肽作為動物消化道蛋白質(zhì)的主要酶解產(chǎn)物,是迅速吸收的氨基酸供體，同時釋放的許多肽具有活性作用，能夠調(diào)節(jié)機體的生命活動[2]，而且，酶水解蛋白還可以釋放生物活性肽[3]，生物活性肽具有眾多有利于動物生長的功能和特點，一些生物活性肽可通過誘導(dǎo)小腸中一些酶活性的提高，促進機體的健康、提高機體免疫力及其生產(chǎn)性能[4]。研究表明，在飼料中添加一定量的生物活性肽能夠調(diào)節(jié)動物體消化系統(tǒng)，提高動物的生產(chǎn)性能，增強動物免疫力，小肽在動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)中的作用越來越受到關(guān)注[5]，玉米蛋白粉是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物玉米面筋粉（Corn Gluten Meal縮寫CGM，俗稱玉米渣），大約含60%的蛋白質(zhì)，主要是由玉米醇溶蛋白（68%）、谷蛋白（22%）和球蛋白（1.2%）組成。然而玉米蛋白水溶性差，組成復(fù)雜，口感粗糙，嚴重影響了其在動物腸道系統(tǒng)內(nèi)的吸收利用，采用生物酶制劑通過較容易的控制條件實現(xiàn)對玉米蛋白粉的有限水解，制備高可吸收的小肽產(chǎn)品對于提高玉米蛋白質(zhì)的利用率、顯著增加其營養(yǎng)價值和保健功能、節(jié)約有限的蛋白質(zhì)飼料資源、減少氮的污染具有重要意義。本文采用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對玉米蛋白進行二次酶解，獲得口味較好、得率較高的小肽產(chǎn)品，并對其氨基酸組成和腸吸收進行了初步研究，以期為酶解玉米蛋白制備小肽作為維護動物腸道健康的飼料添加劑及玉米小肽的進一步復(fù)配奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米蛋白粉(河南新麥茲淀粉廠生產(chǎn)，蛋白含量61.8%)，堿性蛋白酶(諾維信酶制劑公司生產(chǎn)，酶活力100 000 U/ml)，風(fēng)味蛋白酶(諾維信酶制劑公司生產(chǎn)，酶活力 50 000 U/g)，NaOH、HCl；酸度計、水浴槽、超濾裝置、噴霧干燥器，結(jié)晶牛血清白蛋白(中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站)；Folin-酚試劑；臺氏保養(yǎng)液(Tyrodes)；純氧；豚鼠：體重300～650 g，752型紫外可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 玉米小肽的制備

1.2.2 三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）測定

微量凱氏定氮法：取玉米蛋白水解液10 ml，加入10 ml 10%的三氯乙酸（TCA），混合后放置 30 min，于4 000 r/min離心10 min，取離心后的上清液5 ml進行微量凱氏定氮，可測得三氯乙酸氮溶指數(shù)(TCA-NSI)。

1.2.3 玉米小肽腸吸收的初步研究

1.2.3.1 臺氏保養(yǎng)液的配置[6]

NaCl 8 g、KCl 0.2 g、CaCl20.2 g、NaH2PO40.05 g、MgCl0.1g、NaHCO31g、葡萄糖 1g，最后定容到 1000ml。CaCl2單獨溶解并充分稀釋后再與其它成分配成的溶液相混合，否則可能導(dǎo)致碳酸鈣或磷酸鈣沉淀析出，葡萄糖應(yīng)在臨用時加入。

1.2.3.2 玉米小肽的腸吸收測定

豚鼠離體腸囊實驗法[7-8]。豚鼠一只，禁食（不禁水）24 h，然后拉頸處死，立即剖開腹部，輕輕剪取回腸一段，去除系膜，放于臺氏液瓶中洗凈，剪取約5 cm結(jié)扎一端，將其翻轉(zhuǎn)使黏膜面朝外，放入保養(yǎng)液中清洗，取出用濾紙吸干液體，用移液器向腸內(nèi)注入保養(yǎng)液適量以恰好使黏膜表面的絨毛變直為度，扎住。然后將其放入盛有臺氏保養(yǎng)液的三角瓶中，充入純氧，在37℃恒溫水浴槽上緩慢搖動溫浴，溫浴前在黏膜側(cè)保養(yǎng)液中加入一定量的玉米多肽溶液(1 mg/ml)，溫浴1 h。采用Folin-酚法測定溫浴前后回腸內(nèi)玉米小肽的濃度，同時做一空白試驗以校正腸囊本身的影響。

玉米小肽溶液(1 mg/ml)和吸收促進劑脫氧膽酸鈉溶液(2 mg/ml)按10：1混合,按照以上方法測定吸收促進劑脫氧膽酸鈉對玉米小肽腸吸收的影響。

每小時玉米多肽吸收量=溫浴前玉米小肽濃度-溫浴后玉米小肽濃度。

1.2.3.3 玉米小肽含量的測定

采用 Folin-酚試劑法(余冰賓，2004)[9]。

1.2.3.4 標準曲線的繪制

精確稱取結(jié)晶牛血清白蛋白，溶于蒸餾水，配制成 250 μg/ml的標準溶液，分別精密吸取此液 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于試管中，用水補足到 1 ml，依次加入Folin-酚試劑A液5 ml，室溫放置10 min，依次加入Folin-酚試劑B液，立即搖勻，室溫下放置30 min，取出冷卻至室溫，在700 nm處分別測定各管中溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米小肽的制備結(jié)果

pH=9時玉米蛋白粉未經(jīng)任何處理的氮溶指數(shù)僅為6.65%，而經(jīng)過二次酶解后所得的玉米小肽的三氯乙酸氮溶指數(shù)可高達94.1%，玉米小肽得率在73%以上。這是因為隨著酶解的進行，玉米蛋白中可解離的基團(NH+4，COO-)數(shù)目增多，小分子量的小肽分子數(shù)目增多，這些新暴露的離子化氨基和羧基提高了水解產(chǎn)物的親水性，大幅度提高了玉米小肽的溶解性。三氯乙酸能夠沉淀所有的蛋白質(zhì)和長肽，可定性反映蛋白的分解情況，玉米小肽的三氯乙酸氮溶指數(shù)高達94.1%，說明玉米小肽中小肽的含量很高，而且酸穩(wěn)定性很好。

2.2 玉米小肽氨基酸組成(見表1)

表1 玉米小肽氨基酸組成

研究表明，各種必需氨基酸除了要求數(shù)量足夠，還要求互相間的比例恰當才能為機體充分利用，由表1可以看出，玉米蛋白經(jīng)二次酶解后其氨基酸組成中缺乏Lys、Thr、Trp三種機體必須氨基酸，這大大限制了玉米小肽在動物體內(nèi)的充分利用。

2.3 玉米小肽腸吸收的初步研究

2.3.1 標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標，繪制標準曲線如下：

標準蛋白對吸光度的線性回歸方程：y=0.002x+0.039 6，R2=0.991 6。由圖1可以看到，各點在直線兩側(cè)分布均勻，線性回歸良好。

2.3.2 玉米小肽腸吸收量的測定

精密吸取腸囊溫育前后的黏膜側(cè)液0.1 ml，用水補足到1 ml，F(xiàn)olin-酚法測定溫育前后玉米多肽的濃度，計算1 h腸的小肽吸收量，結(jié)果見表2。

表2結(jié)果表明，玉米小肽1 h內(nèi)在5 cm回腸內(nèi)的平均吸收量為47.25 μg/ml，平均吸收率為26.45%，大大高于相同條件下胸腺多肽的平均吸收率17.34%，略低于腦多肽的吸收率31%[10]。

3 結(jié)論

玉米蛋白粉經(jīng)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶二次酶解后，其酶解液的三氯乙酸氮溶指數(shù)（TCA-NSI）高達94.1%，玉米小肽得率在73%以上，并且經(jīng)豚鼠離體腸囊實驗法測定玉米小肽的腸吸收結(jié)果表明：玉米小肽1 h內(nèi)在5 cm回腸內(nèi)的平均吸收量為47.25 μg/ml，平均吸收率為26.45%，大大高于相同條件下胸腺多肽的平均吸收率17.34%，略低于腦多肽的吸收率31%。

表2 玉米小肽1 h內(nèi)在5 cm回腸內(nèi)的吸收量及吸收率

小腸內(nèi)消化是整個消化過程中最重要的階段，飼料通過小腸后，消化過程基本完成，許多營養(yǎng)物質(zhì)也在小腸被吸收,由于離體腸囊實驗法將腸道內(nèi)的各種酶清洗掉了,因此不存在對小肽的降解作用，完全是小腸對玉米小肽的自然吸收，而且由表1可知，玉米小肽中缺乏3種必需氨基酸，這限制了玉米小肽的充分利用，由此可以推斷,如果在正常的體內(nèi)腸道生理條件下，在各種酶的作用下，如果補充以缺少的必需氨基酸，玉米小肽的吸收率會更高。正是玉米小肽在小腸內(nèi)高的自然吸收率，小肽對于促進動物腸道系統(tǒng)的早期快速發(fā)育、增強消化系統(tǒng)發(fā)育尚未成熟、消化酶活性低及患有胃腸疾病動物的營養(yǎng)吸收、維護腸道健康、補充動物在快速生長期和高產(chǎn)期對氨基酸的需求具有重要意義，因此，酶解玉米蛋白制備玉米小肽作為飼料添加劑，對于調(diào)控動物的營養(yǎng)生理代謝機制，維護動物腸道健康，進一步提高動物生產(chǎn)性能和健康水平，具有廣闊前景。

[1]杜保華.寡肽在動物營養(yǎng)消化吸收中的作用[J].飼料研究,2011(1):24-26.

[2]施用暉,樂國偉.生物活性小肽在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用前景[J].飼料工業(yè),2001,22(7):34-36.

[3]陳新,陳慶森,龐廣昌.酶解玉米蛋白生產(chǎn)生物活性多肽的研究現(xiàn)狀及開發(fā)趨勢[J].食品科學(xué),2004,25(7):202-205.

[4]計成.新型蛋白質(zhì)飼料開發(fā)與利用[M].化學(xué)工業(yè)出版社,2006(1):92-98.

[5]陳路,張日俊.生物活性肽（或寡肽）飼料添加劑的研究與應(yīng)用[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2004,16(2):12-15.

[6]張忠泉,包翠屏.藥理學(xué)實驗指導(dǎo)[M].河南醫(yī)科大學(xué)出版社,2000(11):7-8.

[7]徐叔云.藥理學(xué)實驗方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982:878.

[8]何盛江,欒立標.翻轉(zhuǎn)腸囊法法研究吸收促進劑對小腸吸收苦參堿的作用[J].藥學(xué)進展,2004,28(3):126-128.

[9]余冰賓.生物化學(xué)實驗指導(dǎo)[M].清華大學(xué)出版社,2004(1):133-136.

[10]熊玉卿,付穎君,周秦秦,等.腦多肽腸吸收的實驗研究[J].中國藥理學(xué)通報,1996,1(6):573.