腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟高敏感性與腦腸互動的研究

唐慶林，宮秀群，馮根寶，李雪飛，汪芳裕

(本文編輯:張仲書; 英文編輯:王建東)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴排便習慣改變和(或)糞便性狀改變的功能性腸病，缺乏可解釋癥狀的形態(tài)學和生化學異常［1-2］。IBS的病因和發(fā)病機制尚不明確，內(nèi)臟高敏感性(visceral hypersensitivity，VH)和腦腸互動(brain-gut interaction，BGI)是當前的研究熱點［3-4］。本研究通過建立腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，DIBS)大鼠模型，探討VH與BGI在IBS發(fā)病和病理生理學中的可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體重270～310 g，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供，許可證號:SCXK(軍)2007-012。

1.2 動物模型及指標檢測

1.2.1 模型建立 大鼠24只，隨機分為模型組(A組)和對照組(B組)，每組各12只，按參考文獻［5］方法建立模型，實驗方案得到南京軍區(qū)南京總醫(yī)院實驗動物倫理委員會的批準。實驗前，大鼠正常飲水，禁食12 h后將其置于固定器(蘇州蘇杭公司，5 cm×5 cm×20 cm)內(nèi)，以頭低尾高位固定，經(jīng)肛門插入自制大鼠灌腸管至距肛門8 cm，緩慢灌入4%乙酸(成都科龍試劑廠)1 ml，用浸濕生理鹽水的棉簽壓迫肛門口約30 s(防止液體溢出)，再予1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗腸道后緩慢拔出灌腸管，后正常飼養(yǎng)6 d。B組用生理鹽水代替乙酸灌腸。第7天評價模型并取材。

1.2.2 直結(jié)腸擴張實驗(colorectal distension，CRD) 實驗第6天禁食24 h，禁水12 h;第7天，兩組大鼠分別于清醒狀態(tài)下放入大鼠固定器中，參考文獻方法［5］，將8F導尿管(Euromedical公司，導管直徑2.7mm，球囊最大容量3ml)經(jīng)肛門緩慢插入，氣囊末端距肛門約2 cm并固定。待30 min后大鼠適應，經(jīng)外口氣囊內(nèi)先后注入37℃生理鹽水(0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 和 1.0 ml)擴張，按腹部回撤反應(abdominal withdrawl reflex，AWR)標準［5］評分，每4分鐘一次，每次約30 s，每一個評分重復3次，取平均值。

1.2.3 Bristol糞便性狀評分 實驗第7天觀察大鼠糞便情況并按文獻標準［2］評分，其中4、5級為正常，其余為異常。

1.2.4 小腸推進實驗 實驗第7天，每只大鼠予印度墨汁0.3 ml灌胃，20 min后，腹腔注射3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，剖腹游離出小腸(十二指腸始端至回盲部)平鋪于白紙上，記錄印度墨汁在小腸中移行距離及整段小腸長度，以印度墨水在小腸中移行距離占整段小腸長度的百分比值，作為小腸推進百分率來評價小腸推進運動情況。

1.2.5 標本采集、病理切片及免疫組化染色 實驗第2天，隨機取A組及B組大鼠各2只，麻醉后取大鼠結(jié)腸(距肛門約10 cm處)1 cm腸段，常規(guī)HE染色。其余大鼠第7天麻醉后予心臟穿刺插管至主動脈根部，剪破右心耳，以生理鹽水200ml快速灌注沖洗，待沖洗液清亮后，予多聚甲醛緩沖液(40 g/L)250 ml固定。取出完整大腦、脊髓(L4～6)、結(jié)腸(距肛門約10 cm處)1 cm腸段，以10%甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，結(jié)腸及脊髓連續(xù)切片，腦組織按前囟后方1.5 mm至5.0 mm連續(xù)冠狀切片，自大腦正中至左2.0 mm連續(xù)矢狀切片，片厚4μm，隔5張取1張。每例每部位取2張，置于防脫載玻片上，烤箱60℃ 30 min使切片緊密黏附。使用濃度為1∶100稀釋的c-fos抗體(北京博奧森生物公司)，按SP法免疫組化法進行標記，按說明書操作。染色結(jié)果分析:在光學顯微鏡下，每張切片在400倍鏡下隨機取3個視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定各組切片中抗體呈陽性反應的細胞數(shù)、累計光密度(integrated optical density，IOD)進行半定量分析，IOD值代表組織染色強度，IOD值越大，代表染色越強。所有大鼠結(jié)腸免疫組化操作前行常規(guī)HE染色。

2 結(jié)果

2.1 CRD 結(jié)果 當容量擴張≥0.3 ml時，A 組AWR評分明顯高于B組(P＜0.05，表1)。A組內(nèi)比較，容量擴張分別為 0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml時，組內(nèi)對應AWR值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，容量擴張分別為 0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml時，組內(nèi)對應的AWR值比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明容量擴張達0.6 m l時，腸道致敏達一定閾值，但與B組比較，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 兩組大鼠AWR評分比較(±s)

表1 兩組大鼠AWR評分比較(±s)

注:組內(nèi)比較，*P ＜0.05;與 B 組同期比較，△P ＜0.05

容量(/ml) A組 B組0.1 0.20 ±0.42*0.00 ±0.00 0.2 0.80 ±0.63* 0.20 ±0.42 0.3 1.70 ±0.48＊△ 0.40 ±0.52 0.4 2.60 ±0.52＊△ 1.20 ±0.42 0.6 3.30 ±0.48△ 2.00 ±0.00 0.8 3.30 ±0.48△ 2.00 ±0.00 1.0 3.60 ±0.52△2.60 ±0.52

2.2 Bristol評分 A組大鼠糞便多為稀便或糊便狀，其 Bristol評分為(5.80±0.42)，而 B 組大鼠糞便多為團塊狀或臘腸樣，其Bristol評分為(4.00±0.82)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，且 A 組符合D-IBS。

2.3 小腸推進試驗結(jié)果 A組小腸推進百分率為(70.58 ±5.11)%，B 組為(54.92 ±4.38)%，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，A組小腸推進較B組顯著要快。

2.4 結(jié)腸外觀變化及HE結(jié)果 造模后第2天，與B組相比，A組大鼠結(jié)腸外觀管腔增大，管壁增厚，伴充血及出血，鏡下可見黏膜層、黏膜下層水腫明顯，出現(xiàn)片狀出血點。實驗第7天，兩組腸黏膜外觀及HE染色均無異常。

2.5 免疫組化結(jié)腸、脊髓背角、海馬、下丘腦c-fos表達 與B組相比，A組結(jié)腸可見較多細胞胞漿呈棕褐色的c-fos陽性細胞，主要分布于黏膜層(圖1);脊髓背角可見大量胞漿棕色的c-fos陽性神經(jīng)元細胞;下丘腦、海馬可見多個胞漿褐色的c-fos陽性神經(jīng)元細胞，與B組相比，細胞數(shù)目及IOD值明顯增高(P ＜0.05，表2)。

3 討論

IBS是臨床常見的一組消化系統(tǒng)癥候群，其病因及發(fā)病機制尚無定論。VH是指內(nèi)臟組織器官對刺激的感受性增強的現(xiàn)象，越來越多的研究表明，VH是IBS主要的病理生理特征［6］。由于IBS是一種功能性胃腸病，取得患者的腦和脊髓等組織進行研究相對困難，利用動物模型則可為研究提供良好的基礎(chǔ)和條件。應用較廣泛的模型主要是通過化學或機械刺激造模，目前常用的大鼠模型有成年大鼠直腸化學刺激［5］、幼鼠腸道化學刺激［7］等。本實驗選用成年大鼠乙酸灌腸造模模擬人類D-IBS，當CRD容量擴展≥0.4ml時，A組AWR評分≥2分，達到傷害感受疼痛閾值時［5］，符合 VH，與 B組相比，實驗數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 免疫組化結(jié)腸、脊髓背角、海馬、下丘腦c-fos表達(SP×400)

表2 兩組大鼠c-fos表達比較(±s)

表2 兩組大鼠c-fos表達比較(±s)

注:與B組同部位比較，*P＜0.05

部位細胞數(shù)目A組 B組IOD值A(chǔ)組 B組結(jié)腸 63.80 ±7.71* 53.20 ±6.03 4630.76 ±920.99*3003.67 ±949.19脊髓背角 13.20 ±1.93* 9.20 ±1.55 6675.18 ±2.08* 1963.77 ±1.84下丘腦 61.70 ±5.03* 51.40 ±5.36 2595.18 ±773.86* 1461.58 ±420.18海馬 164.80 ±9.13* 151.80 ±7.41 614.94 ±144.33*319.28 ±121.05

高級神經(jīng)中樞與腸道的相互作用稱為“腦腸互動(BGI)”，BGI概念的提出有助于我們進一步理解IBS的發(fā)病機制［8］。c-fos是一種存在于神經(jīng)細胞內(nèi)的即刻早期基因，在感覺通路中表達。當機體受到刺激時，其表達會有所改變，目前其在BGI研究中成為關(guān)注熱點［9］。本研究利用c-fos在活體受到外界傷害刺激后，其表達產(chǎn)物可作為傷害性感受神經(jīng)元興奮的標志物的原理［10］，利用免疫組化的方法檢測腦、脊髓背角、結(jié)腸各層面c-fos的表達和分布，以初步探討VH與BGI的關(guān)系。IBS內(nèi)臟高敏感的形成是一個復雜的過程，腦腸軸多個層面均參與其中，腸道刺激作用外周感受器后，經(jīng)神經(jīng)元傳遞至中樞。脊髓背角是內(nèi)臟感覺傳入纖維的匯聚之所，是腸道與中樞信號傳遞的“中繼站”，在腦-脊髓-結(jié)腸互動中起重要作用。本研究中，模型組大鼠呈現(xiàn)內(nèi)臟高敏感，各層面c-fos表達均升高，推測可能是化學刺激導致腸道炎癥，內(nèi)臟感受器激活，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對外周信號放大、致敏，腸道傳入脊髓傷害性信號增多，導致脊髓背角神經(jīng)元興奮性升高，經(jīng)神經(jīng)傳遞至腦。雖然腸道有炎癥自我修復功能，但中樞自我恢復能力不如腸道，仍通過下行通路作用于脊髓背角，影響內(nèi)臟感覺。另外，本研究結(jié)果表明，模型組內(nèi)臟高敏感，下丘腦、海馬、脊髓背角、結(jié)腸的c-fos陽性細胞表達升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。海馬和下丘腦c-fos表達量明顯升高，提示這兩個部位可能在高級中樞致敏中起重要作用，這可能與這兩個部位的功能有關(guān)。

綜上所述，我們的初步研究表明，BGI與VH有一定關(guān)系，c-fos參與VH的調(diào)節(jié)，這為深入研究IBS發(fā)病機制乃至治療提供了新的思路。

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