Ⅰ型聚酮類天然產(chǎn)物中利用點突變產(chǎn)生類似物的研究

劉偉 高菊芳

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 2000234)

生物化工

Ⅰ型聚酮類天然產(chǎn)物中利用點突變產(chǎn)生類似物的研究

劉偉 高菊芳

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 2000234)

點突變是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、改變等。通過構(gòu)建發(fā)生突變的質(zhì)粒利用遺傳轉(zhuǎn)移的方法同源重組到野生型基因組中，使得氨基酸改變從而引起蛋白功能發(fā)生變化，獲得鑒定正確的突變株后發(fā)酵篩選結(jié)構(gòu)類似物。聚酮類天然產(chǎn)物在生物合成過程中，其聚酮鏈會發(fā)生若干步氧化還原反應(yīng)，通過點突變的方法失活該蛋白，從而跳過該步氧化還原反應(yīng)的作用，產(chǎn)生PKS骨架上的改變，從而得到結(jié)構(gòu)類似物。

聚酮類化合物；點突變；結(jié)構(gòu)類似物

聚酮類天然產(chǎn)物是一大類以乙酰或丙二酰單酰輔酶A為延伸或者起始模塊，在聚酮合成酶（polyketide synthase，PKS）催化下經(jīng)過多輪克萊森縮合（Claisen縮合）和高度修飾后形成的天然產(chǎn)物，許多細(xì)菌尤其是放線菌、真菌甚至植物都具有形成此類天然產(chǎn)物的能力，一般來講，該合成階段都發(fā)生在次級代謝階段，有些甚至不是其生長繁殖所必需[1-2]。

這一類天然產(chǎn)物通常具有諸如紅霉素等抑制細(xì)菌、兩性霉素等抑制真菌以及阿霉素等控制癌癥的活性，廣泛運用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等。其良好高效的生物學(xué)活性、巨大的新藥開發(fā)潛質(zhì)、還有獨特的酶學(xué)機制以及蛋白間的相互識別作用無不吸引和推動大家的重視與研究。由于其精密而又經(jīng)濟的合成機制和調(diào)控機制，越來越多的分子生物學(xué)手段在其結(jié)構(gòu)改造上得以實現(xiàn)，這無論是對于對抗由于細(xì)菌耐藥性廣泛的出現(xiàn)而引起的抗生素受限還是揭示新的非化學(xué)合成的各種反應(yīng)都具有巨大的意義。本文關(guān)于聚酮合酶的操作就是利用組合生物合成的方法得到了該天然產(chǎn)物的類似物[3]。

聚酮化合物是通過聚酮合酶（polyketide sythase，PKS）催化形成，目前已知的聚酮合酶分為三大類，分別為Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型PKS。

Ⅰ型PKS是一個由許多功能域（domain）組成的蛋白，其中至少需要以下三個功能域，即酰基轉(zhuǎn)移酶（acyl tranferase,AT）、酰基載體蛋白 （acyl carrier protein,ACP）和酮基合成酶（ketosynthase，KS），由KS催化AT上的羧酸起始單元或者延伸單元縮合。其次有些非關(guān)鍵的功能域 （并非所有的蛋白中均含有），包括脫水酶 （dehydratase,DH）、烯醇還原酶（enyol reductase,ER）、酮基還原酶(ketoreductase,KR)，中途可以負(fù)責(zé)聚酮鏈的修飾、脫水或者還原。最后在硫酯酶（thioesterase，TE）的解離下從PKS上脫落，然后利用后修飾基因?qū)ζ溥M行進一步的催化，比如環(huán)化、糖基化等過程，形成最后的產(chǎn)物。

Ⅱ型PKS是一個多功能酶復(fù)合體，只包含一套可以重復(fù)使用（interative）的結(jié)構(gòu)域，每一結(jié)構(gòu)域在重復(fù)的反應(yīng)步驟中多次用來催化相同反應(yīng)，包含了KSα，KSβ，ACP，其中除ACP為?；d體蛋白以外，通常認(rèn)為KSβ與KSα不僅負(fù)責(zé)聚酮鏈延伸和小分子羧酸的縮合，而且負(fù)責(zé)聚酮鏈的鏈長控制。

Ⅲ型PKS比較特殊，它是一類直接利用?；?COA上的羧酸進行縮合，一般不需要酰基載體蛋白上的磷酸泛酰巰基乙胺[3-4]。

隨著細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生，市場對于高效低毒的新型化合物的需求，以及化學(xué)合成上的困難，對于篩選結(jié)構(gòu)類似活性更高的天然產(chǎn)物類似物，就有了更大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)意義上的物理誘變篩選因其工作量大，效果不明顯等缺點已經(jīng)不能夠滿足對于良好活性類似物的要求。因此科學(xué)家們開始在對其生物合成途徑中的酶進行選擇性的失活來產(chǎn)生新化合物。本文旨在介紹利用點突變的方式使得蛋白功能缺失，從而使得天然產(chǎn)物在其合成過程中跳過該蛋白的催化步驟，在立體結(jié)構(gòu)或者骨架基團上產(chǎn)生變化，產(chǎn)生"非天然"的天然產(chǎn)物，以期獲得更好更高效的化合物[5]。

點突變是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系以及確認(rèn)結(jié)構(gòu)域或特定氨基酸所處位置的重要手段，一般用來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和對DNA分子的修飾。同時還可以通過點突變改變氨基酸殘基來引起目標(biāo)蛋白的失活，導(dǎo)致其功能缺失。在Ⅰ型PKS中利用點突變來跳過或者失活某目標(biāo)蛋白的催化功能，從而產(chǎn)生與該天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似（如羥基保留）的產(chǎn)物[6]。其主要操作方法包括重疊延伸法、擴增質(zhì)粒全長法、試劑盒等[7-8]。

聚酮合酶中還原型功能域的點突變失活較為常用的方法為重疊延伸法，其主要原理為利用PCR的方法引入所需突變（將突變堿基設(shè)置在引物中），成功后利用大腸桿菌與鏈霉菌等的同源重組構(gòu)建至野生型菌株（結(jié)合轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)化等方式），同時利用同義突變引入酶切位點進行驗證，加上測序等手段檢測到成功突變的突變株。進一步發(fā)酵檢測尋找目標(biāo)產(chǎn)物[9]。

1 格爾德霉素類似物的產(chǎn)生

格爾德霉素（Geldnamycin）是一類苯醌類大環(huán)內(nèi)酯，因其可以競爭性的抑制熱激蛋白，所以曾被考慮作為抗癌藥物，但是由于其肝毒性阻止了進一步的臨床應(yīng)用，于是就啟發(fā)人們?nèi)ふ叶拘越档偷念愃莆铩Ｆ渲?7-丙?；被?17-去甲氧基格爾德霉素已經(jīng)在進行一期、二期臨床試驗。

格爾德霉素由吸水鏈霉菌NRRL3602產(chǎn)生，它是通過一個3-氨基-5-羥基-苯甲酸（AHBA）的前體裝載至前體合成功能域上，經(jīng)過三個PKS酶的催化，完成了七步的延伸，形成了聚酮鏈，隨后在解離后通過一系列的后修飾，最終形成完整的分子[10-11]。

韓國科學(xué)家Young-Soo Hong等[12]利用對PKS酶中個別功能域的點突變，選擇格爾德霉素生物合成基因簇中g(shù)elA基因中的DH1功能域，將其催化中心的HIS殘基定點突變，產(chǎn)生功能缺失的脫水酶，因此保留了格爾德霉素15位的羥基，利用PCR的方法引入關(guān)鍵氨基酸的失活，然后利用大腸桿菌和鏈霉菌的同源重組，發(fā)生兩次交換后廢除了蛋白的功能。

通過抗性篩選到突變成功的突變株，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了新的化合物，由于DH的失活，使得在聚酮鏈上的羥基得以保留，最終檢測發(fā)現(xiàn)，根據(jù)MS分子量推斷，該化合物正是15位保留羥基的格爾德霉素衍生物，這一化合物成功檢測到后，該課題組利用同樣的操作方法對聚酮合酶進一步進行選擇性的失活，通過失活基因簇中相應(yīng)的后修飾基因獲得了下列的類似物：

DHQ1：除了因DH5失活而得以保留的羥基外，將gel16進行失活，從而使得C4,C5之間的雙鍵飽和，并且負(fù)責(zé)17位后修飾基因gel16失活，gel16負(fù)責(zé)將格爾德霉素中的C4,C5間的雙鍵的形成，產(chǎn)生DHQ1,并且由于C15位與C11位發(fā)生了脫水形成一個環(huán)氧的結(jié)構(gòu)，DHQ2為保留有C4,C5間雙鍵的DHQ1,對于基因簇中的后修飾基因gel7突變，產(chǎn)生了C-15位羥基，C-17位去甲氧基的格爾德霉素類似物DHQ3，對于基因簇中g(shù)el7和gel8進行雙突變，得到了DHQ4，即去甲?；腄HQ3。

利用酵母Hsp90 ATP酶含量測定的方法來對圖3的化合物進行活性測定(見表1)。

表1 格爾德霉素以及類似物的活性測定

其中發(fā)現(xiàn)15位羥基，17位去甲氧基格爾德霉素DHQ3相對于原來的格爾德霉素，活性提高了將近5倍，而其余的三個類似物沒有活性[12]。

2 制霉菌素類似物的產(chǎn)生

制霉菌素A1（NystatinA1）是一類多烯類大環(huán)內(nèi)酯廣譜抗真菌藥，由諾爾斯鏈霉ATCC11455產(chǎn)生，兩性霉素B（Amphotericin B）是其較著名的類似物，與制霉菌素A1差別不大，一是在C28~C29位的差別，前者是一個雙鍵，而制霉菌素A1則為飽和鍵，二是兩性霉素中C8位上含有羥基，C10位為飽和鍵，而制霉菌素相反[13]。

2005年挪威科學(xué)家揭示了制霉菌素的生物合成過程，它由一個乙酸單位起始，經(jīng)過18次的延伸，每次裝載一個二碳單元，最后在硫酯酶的作用下水解離開聚酮合成酶，形成一個三十八元大環(huán)內(nèi)酯，聚酮合成酶中的還原性功能域催化形成了大環(huán)內(nèi)酯上的烯基，之后再經(jīng)過后修飾基因?qū)τ诠羌苓M行進一步的催化，最后形成制霉菌素A1[14]。不同構(gòu)造的還原型功能域和其不同活性功能對于最后骨架上的基團一一對應(yīng)，例如在KR,KR+DH,KR+DH+ER分別存在的情況下會產(chǎn)生制霉菌素骨架上的羥基，雙鍵以及飽和單鍵[15]。

由于制霉菌素的溶血毒性及可溶性等問題，限制了其在人系統(tǒng)性真菌病中廣泛應(yīng)用，所以對于其活性類似或者更高但毒性減少甚至消失的類似物的發(fā)現(xiàn)和制備提出了要求。

S44HP是2004年由Bruheim等人通過對制霉菌素生物合成基因簇Nysc蛋白中的烯醇還原酶5（ER5）點突變失活，成功篩選得到發(fā)酵突變株，發(fā)酵檢測得到了C28~C29位烯基保留的制霉菌素的類似物，其抗菌活性與兩性霉素相當(dāng)，比制霉菌素的活性要高?？赡艿脑蚴且驗樵诮Y(jié)構(gòu)上更加類似。但是可溶性是兩性霉素的10倍左右。

2008年，Sergey B Zotchev等人利用點突變的方法將NysJ中ORF15的脫水酶功能域（DH15）中催化殘基His失活，使得C9位上的羥基得以保留，得到了類似物BSG002,由于這一改變，使得后修飾基因NysL不能正確的識別原先C9位并沒有羥基的結(jié)構(gòu)，因而不能執(zhí)行其對于C10位的羥化反應(yīng)，活性測試表明，與制霉菌素A1相比，BSG002雖然在其溶血活性上至少降了兩倍，但是同時，其抗真菌的活性也降到了制霉菌素A1的四分之一。由于該突變株的基因型發(fā)生了改變，引起了BSG002產(chǎn)量的下降，在同等發(fā)酵條件下，僅有野生株產(chǎn)制霉菌素產(chǎn)量的30%左右。

NysN負(fù)責(zé)的是C16位的氧化，該基因編碼一個假定的P450單加氧酶，序列分析發(fā)現(xiàn)其保守氨基酸Cys346可能是血紅素的結(jié)合位點，因此利用點突變的方法將其突變?yōu)锳la,產(chǎn)生突變株CL346AS，發(fā)酵檢測發(fā)現(xiàn)該突變株產(chǎn)生了16-去羧基-16-甲基制霉菌素（16-DecNys）,體外活性測試顯示，其溶血活性下降了約兩倍的同時，抗真菌活性幾乎沒有發(fā)生變化。也就是說，由于該氧化酶的失活，使得16位羧基被甲基替換，因而降低了制霉菌素的毒性。同時突變株CL346AS合成16-DecNys的產(chǎn)量非常低，僅有同等發(fā)酵條件下制霉菌素產(chǎn)量的2%。據(jù)推測可能存在有未知的反饋抑制。

在S44HP的突變株的基礎(chǔ)上，同樣將 NysN基因失活，得到了16-甲基-28-29脫氫的制霉菌素類似物BSG005，抗菌活性比S44HP提高了近兩倍，比制霉菌素A1提高了20倍。而且與16-DecNys相比，產(chǎn)量提高了20倍。

同樣，在S44HP的突變株中，失活NysJ中酮基還原酶16(KR16)和酮基還原酶17（KR17）中活性位點Tyr,使得在制霉菌素A1多元醇的區(qū)域中C7和C5位的羥基被酮基所取代，得到相應(yīng)的類似物BSG017和BSG013，活性測試發(fā)現(xiàn)與S44HP相比，BSG013的抗真菌活性大約降低了兩倍，而溶血毒性有大約1.2倍的提高，而BSG017的抗真菌活降到S44HP的四分之一，溶血毒性大約1.3倍的提高。其產(chǎn)生菌株的產(chǎn)量與S44HP產(chǎn)生菌相比，均下降為其56%與49%。

接著作者利用BSG017和BSG013的突變株，將NysN基因失活，進一步得到16位脫羧基甲基取代的 BSG017和 BSG013，命名為 BSG031和BSG020，即為5-酮基-16-甲基-28-29脫氫-制霉菌素A1，7-酮基-16-甲基-28-29脫氫-制霉菌素A1?；钚詼y試表明 BSG031和 BSG020分別比S44HP的溶血毒性更大程度的降低，而抗菌活性得到了提高。產(chǎn)量相應(yīng)也下降為S44HP產(chǎn)生菌的20%與29%。

上述類似物活性匯總，以白色念珠菌ATCC10231為測活菌株，以馬血紅細(xì)胞為出發(fā)細(xì)胞株作為溶血活性測試品株。體外測活結(jié)果如表2。

表2 通過基因工程獲得的制霉菌素類似物抑菌活性與溶血毒性測試

同時對于制霉菌素和兩性霉素B以及類似物S44HP、BSG002、BSG005、BSG020進行被感染大鼠中體內(nèi)測活，其結(jié)果與體外測活均一致[16]。

3 小結(jié)

由于Ⅰ型PKS中各個還原型結(jié)構(gòu)域的存在程度不同，通過點突變這一方法，失活這些對于最終的天然產(chǎn)物骨架進行氧化還原的功能域，因而產(chǎn)生大量的結(jié)構(gòu)類似物，這些改變的基團對于最終產(chǎn)物的溶解性、毒性、抗菌活性等至關(guān)重要。與傳統(tǒng)的物理誘變篩選，點突變這一方法有著明顯的優(yōu)勢：

（1）快捷直接。由于分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，通過在基因水平直接對于基因的修飾和改變，產(chǎn)生蛋白功能的變化，合理的設(shè)計加上日趨成熟的操作，與原先比較盲目、大海撈針?biāo)频暮Y選相比，更加的經(jīng)濟快速?？梢酝瑫r嘗試更多的結(jié)構(gòu)變化體外測活，從而得到更高效更安全的化合物。

（2）由于微生物體中具有很多經(jīng)濟但復(fù)雜的催化機制，通過對其酶蛋白序列的分析和改變，對于很多化學(xué)家感興趣的體內(nèi)經(jīng)典或獨特的催化反應(yīng)進行了補充。

但同時，這一方法也有很多的不足之處，最常見的便是產(chǎn)生的突變株產(chǎn)量嚴(yán)重的下降，例如本文中提到的格爾德霉素類似物DHQ1、DHQ2，因為基因型的改變，這些突變株在和野生型同樣的發(fā)酵條件下，產(chǎn)量有近10倍的減產(chǎn)，再如制霉菌素的研究中，雖然突變株發(fā)酵檢測到BSG020和BSG031提高了抗菌活性而且其毒性有了大大的降低，但是其產(chǎn)量僅為野生型的20%和29%。究竟為什么基因型的某個氨基酸改變，產(chǎn)量就會有如此顯著的差別，還沒有研究透徹，但是也有可能是產(chǎn)生的類似物對于菌株生長的不利或者是參與到了復(fù)雜而又精密的反饋調(diào)節(jié)中。另一方面，由于微生物來源廣泛，對其基因型進行操作存在著比較明顯的差異，常用的遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)在一些特殊來源或者對于生長狀態(tài)要求較為特殊的菌株并不奏效，但隨著生物技術(shù)的愈發(fā)成熟，相信點突變這一年輕而又古老的技術(shù)在遺傳改造和化合物篩選中愈發(fā)舉足輕重。

[1]Leonard Katz.Manipulation of modular polyketide synthases[J].Chem.Rev.,1997,97:2557-2575.

[2]許楊，魏康霞.真菌聚酮合酶基因的研究進展 [J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2008，3，27:2，1-5.

[3]孫宇輝，鄧子新.聚酮化合物及其組合生物合成 [J].中國抗生素雜志,2006，1:6-14.

[4]胡又佳，朱春寶，朱寶泉.組合生物合成研究進展[J].中國抗生素雜志,2001，26，5:321-330.

[5]Donadio S,Staver M J,et al.Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis[J].Science，1991,252:675.

[6]Cortes J,Wiesmann K E,et al.Repositioning of a domain in a modular polyketide synthase to promote specific chain cleavage.[J].Science,1995,268:1487.

[7]劉炳輝，曹元銀，閆建芳，等.聚酮類化合物生物合成基因簇與藥物篩選[J].生物技術(shù)通報,2008，4:30-33.

[8]羅師平，冷希崗.基于PCR的體外誘變技術(shù) [J].國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)分冊,2005，28，3:188-192.

[9]周麗萍.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)介導(dǎo)的定點突變方法探索[J].江蘇大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）,2003，13（4），364-365.

[10]DeBoer C,Meulman P A,et al.Geldanamycin,a new antibiotic[J].J.Antibiot,1970,23:442-447.

[11]Rascher A,Hu Z,et al.Cloning and characterization of a gene cluster for geldanamycin production in Streptomyces hygroscopicus NRRL 3602 [J].FEMS Microbiol.Lett,2003, 218:223-230.

[12]WoncheolKim,Dongho Lee,etal.Rational Biosynthetic Engineering for Optimization of Geldanamycin Analogues[J].ChemBioChem,2009,10:1243-1251.

[13]Treshchalin I D,Sletta H,et al. Comparative analysis of in vitro antifungal activity and in vivo acute toxicity ofthe nystatin analogue S44HP produced via genetic engineering[J].Antibiot.Khimioter,2005,50:18-22.

[14]Brautaset T,Sekurova O N,et al.Biosynthesis of the polyene antibiotic nystatin in Streptomyces noursei ATCC 11455:analysis of the gene cluster and deduction of the biosynthetic pathway[J].Chem.Biol,7:395-403.

[15]Espen Fjaervik,Sergey B Zotchev.Biosynthesis of the polyene macrolide antibiotic nystatin in Streptomyces noursei[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2005,67:436-443.

[16]Trygve Brautaset,Ha vard Sletta,et al.Improved antifungal polyene macrolides via engineering of the nystatin biosynthetic genes in streptomyces noursei [J].Chemisry& Biology,2008,15:1198-1206.

Study of Analogues in Polyketides Compounds Type I Produced by Site Mutation

LIU Wei,GAO Ju-fang (College of Life and Environment Science,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

Site mutation is a method to change the DNA strand about the purpose strains by PCR(the change always towards the positive side),including add，delete orchange the bases.Changing the amino acid by homologous recombination via conjugation transfer between the wild type strain and the mutation plasmid,the function of protein is altered,even abolished.Then screening the right mutant and fermenting to find the new expected structural analogues.During the biosynthesis of polyketide natural products,there are many oxidationreduction reactions,so skip some step which the inactivation protein can not catalytic,get the change in the PKS skeleton and then the new analogues.

polyketide compounds；site mutation；structural analogues

1006-4184（2012）07-0025-05

2012-04-29

劉偉(1985-)，男，微生物學(xué)專業(yè)碩士研究生。從事分子生物學(xué)相關(guān)研究。

指導(dǎo)老師：高菊芳（1962-），女，副教授。