麥角酰胺產(chǎn)生菌Claviceps paspali的復合誘變及理性篩選

王相晶，王金平，張 繼，張勻華

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院博士后工作站，哈爾濱 150086；2.東北林業(yè)大學博士后流動站，哈爾濱 150040；3.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

麥角酰胺是一種簡單的麥角生物堿（簡稱麥角堿），具有四環(huán)麥角靈的結構特征，由子囊菌麥角菌屬（Claviceps）真菌代謝產(chǎn)生。麥角堿對人體具有藥理作用，在傳統(tǒng)醫(yī)學中，麥角浸出物被用于治療婦科產(chǎn)后出血；在現(xiàn)代醫(yī)學中，麥角堿已被廣泛用于治療神經(jīng)內分泌、腦血管系統(tǒng)的疾?。ㄈ缋夏晷园V呆）以及產(chǎn)后止血，同時還能作為原料用于合成其他重要藥物。研究表明，麥角堿的生理作用大多源于其母體結構—麥角靈與去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺等神經(jīng)介質結構上的相似性[1]。因此，麥角堿研究引起了廣泛關注[2-4]。

在天然狀態(tài)下，麥角菌寄生于禾本科植物子房內，夏秋之際使得寄主子房呈現(xiàn)外紫內白、形狀如動物之角的固體，由此得名“麥角”。因野生的麥角產(chǎn)量不足，并受到自然條件的限制，麥角堿的生產(chǎn)主要通過麥角菌的發(fā)酵而獲得。幾十年來，國外科研人員在菌種的選育、發(fā)酵工藝及培養(yǎng)條件等方面進行了大量研究，取得了很多成果，并用于生產(chǎn)[5-7]。國內雖然也有利用麥角菌發(fā)酵生產(chǎn)麥角酞胺、麥角新堿和麥角隱亭的報道，但由于研究工作不夠深入，麥角堿生產(chǎn)率低，生產(chǎn)成本高，無法用于生產(chǎn)。至今，國內的麥角堿類藥物仍然依賴進口。

提高微生物發(fā)酵產(chǎn)量，誘變是最行之有效的方法。國內外關于麥角菌研究的報道，多為單一的紫外誘變或者化學誘變，復合誘變的報道鮮少看見[2,8-9]。此外，研究者在工業(yè)微生物育種中從生物合成途徑出發(fā)，運用理性篩選的方法選育高產(chǎn)菌株[10-11]。但這種方法多用于產(chǎn)抗生素菌株，多數(shù)為自身代謝產(chǎn)物耐受性篩選，完全從生理特性出發(fā)的報道還未見。本文以麥角酰胺產(chǎn)生菌Claviceps paspali為研究對象，從其生理特性以及發(fā)酵過程調控出發(fā)，運用復合誘變與理性篩選結合的方式篩選出高產(chǎn)菌株，并進行擴大培養(yǎng)，對其發(fā)酵條件進行初步研究，為麥角酰胺的工業(yè)生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

麥角菌HY17-3：東北農(nóng)業(yè)大學生物化工實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面及分離平板培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，切塊煮沸0.5 h后過濾，加瓊脂20 g，葡萄糖20 g，加去離子水至1 000 mL，用濃氨水調pH值為7.0。

搖瓶種子培養(yǎng)基：甘露醇40 g，琥珀酸10 g，KH2PO41 g，豌豆粉1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，加去離子水至1 000 mL，用氨水調pH為5.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：山梨醇100 g，玉米漿30 g，琥珀酸胺40 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，加去離子水至1 000 mL，用NaOH調pH 5.2。

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變、甲基磺酸乙酯（EMS）復合誘變

將麥角菌HY17-3接種于斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d。刮取長好的新鮮斜面培養(yǎng)物于裝有10 mL無菌水的滅菌磨砂試管內，用磨砂玻璃棒研磨成勻漿狀，然后置于預熱半小時的紫外燈下進行紫外誘變。紫外燈功率30 W，距離30 cm，時間9 min。

冰浴條件下取0.5mLEMS原液加入10mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol·L-1，pH7.2），配制成0.1mol·L-1母液備用。將上述經(jīng)紫外誘變的菌液用羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（pH 7.2）稀釋10倍后，取5 mL至無菌離心管中，并加入1 mL的EMS母液，并用HEPES緩沖液稀釋使EMS的終濃度為0.01 mol·L-1。然后將菌懸液置于28℃的搖床上250 r·min-1振蕩。1 h后，取1 mL菌懸液于無菌的離心管中20 000 r·min-1離心2 min，棄上清，加入1 mL 12%的硫代硫酸鈉吹打洗滌終止反應，重復洗滌5次備用。

1.2.2 篩選劑及抗性突變篩選

將復合誘變過的菌體勻漿梯度稀釋后涂布于分別含有適當濃度的乙酸鈉平板中，于28℃培養(yǎng)14 d，篩選耐受性突變株，并挑取一定數(shù)量的單菌落進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。篩選出高產(chǎn)菌株后重復上述操作涂布于含有一定濃度色氨酸的平板中，同樣篩選出高產(chǎn)菌株。按照這個方法，依次篩選出丁二酸、山梨醇及麥角酸的抗性突變菌株。

1.2.3 30 L發(fā)酵生產(chǎn)工藝

發(fā)酵罐罐體積為30 L，裝液量為15 L，接種量10%，發(fā)酵過程空氣流量控制0.5 VVM，罐溫25 ℃，罐壓0.05 MPa，轉速150 r·min-1，發(fā)酵第9天補加50%的山梨醇600 mL，培養(yǎng)16 d，發(fā)酵結束。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 麥角酰胺發(fā)酵效價的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）[12]。

1.2.4.2 發(fā)酵pH及菌絲濃度測定

發(fā)酵過程中的pH變化采用DELTA 320酸度計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）進行測定；菌絲濃度以PMV表示，具體測定方法見文獻[11]。

1.2.4.3 殘留山梨醇的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）[13]。

2 結果和分析

2.1 乙酸鈉耐受株

通過對麥角堿生物合成途徑的研究，麥角堿的生物合成過程首先是麥角靈環(huán)的合成，即由乙酰CoA生成萜類和生物堿合成的起始物—甲戊二羥酸，進而形成焦磷酸二甲烯丙酯。焦磷酸二甲烯丙酯在二甲烯丙基色氨酸合酶催化下與L-色氨酸發(fā)生環(huán)化得到二甲烯丙基色氨酸，然后由二甲烯丙基色氨酸經(jīng)一系列的生物合成途徑最終生成麥角堿[14]。因此，乙酰CoA是麥角堿產(chǎn)生菌生物合成麥角堿的前體誘導物質，并且該前體物質是麥角堿產(chǎn)生菌的胞內初級代謝產(chǎn)物，屬于內源性前體。一般來說，微生物代謝產(chǎn)物的合成能力與其利用前體的能力是密切相關的，而過量的內源性前體往往對代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有反饋調節(jié)作用。故篩選耐乙酰CoA結構類似物（即乙酸鈉（NaAc））的突變株，有可能獲得麥角酰胺的高產(chǎn)突變株。

以菌株HY17-3為出發(fā)菌株，經(jīng)UV及EMS復合誘變后，篩選出一株乙酸鈉耐受菌株HY6-13。對比自然選育、復合誘變選育和乙酸鈉耐性選育結果，HY6-13效價比自然選育和復合誘變分別提高了9%和4%，具體數(shù)據(jù)見圖1。為了證明其遺傳穩(wěn)定性，傳代培養(yǎng)，得到HY21-9穩(wěn)定菌株，并以HY21-9為出發(fā)菌株，進行下一步的推理選育。

2.2 5-甲基色氨酸耐受株

在微生物次級代謝過程中，次級代謝產(chǎn)物的調節(jié)可通過酶的合成量而進行調節(jié)。二甲烯丙基色氨酸合酶是麥角堿生物合成途徑的關鍵酶之一，色氨酸既是該酶的底物又是誘導物。有文獻表明，色氨酸對麥角酰胺產(chǎn)量有顯著影響[15]，但是隨著色氨酸濃度的增加，產(chǎn)堿量趨于平穩(wěn)，呈現(xiàn)出飽和曲線的特點[16]。因此，通過篩選色氨酸結構類似物5-甲基色氨酸的耐受株有助于解除高濃度色氨酸對菌體自身的抑制作用，從而得到高產(chǎn)菌株。

經(jīng)UV及EMS復合誘變后，以HY21-9為出發(fā)菌株篩選出一株5-甲基色氨酸耐受菌株HY25-16。對比自然選育、復合誘變選育和5-甲基色氨酸耐性選育結果，HY25-16效價比自然選育和復合誘變分別提高了6%和5%，并作為下一輪的出發(fā)菌株，具體數(shù)據(jù)見圖1。

2.3 丁二酸耐受株

在麥角菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，往往含有三羧酸循環(huán)中的一種有機酸作為碳源之一，此有機酸的作用是進入三羧酸循環(huán)使乙酰CoA大量積累，而乙酰CoA的積累對于后期糖的利用以及麥角酰胺的合成有著重要的意義[17]。文獻報道丁二酸對麥角菌產(chǎn)堿能力有顯著影響，產(chǎn)堿量會隨著丁二酸濃度得升高而緩慢升高[18]。但是高濃度的丁二酸對菌體具有抑制作用，因此，通過篩選耐受高濃度丁二酸的菌株，有助于麥角酰胺產(chǎn)量的提高。

經(jīng)UV及EMS復合誘變后，以菌株HY25-16為出發(fā)菌株篩選得到一株丁二酸耐受菌株HY32-19。對比自然選育、復合誘變誘變選育和丁二酸耐性選育結果，HY32-19效價比自然選育和復合誘變選育分別提高了15%和7%，具體數(shù)據(jù)見圖1。

2.4 山梨醇耐受株

據(jù)報道，麥角菌培養(yǎng)基中的高糖分及高碳氮比有助于解除磷酸鹽對次級代謝的抑制作用，從而啟動高水平的氧化代謝，這是細胞合成次生代謝產(chǎn)物所必須的[19]。根據(jù)該報道，篩選高糖分的耐受株將有助于麥角酰胺產(chǎn)量的提高。

經(jīng)UV及EMS復合誘變后，從出發(fā)菌株HY32-19篩選出一株山梨醇耐受菌株HY45-15。對比自然選育、復合誘變誘變選育和山梨醇耐性選育結果，HY45-15效價比自然選育和復合誘變分別提高了6%和4%，具體數(shù)據(jù)見圖1。

2.5 麥角酸耐受株

次級代謝產(chǎn)物耐受型菌株在工業(yè)微生物發(fā)酵中具有十分重要的實用價值，一個菌株的生產(chǎn)能力與耐受自身代謝產(chǎn)物的濃度呈正相關性。因此，真正的高產(chǎn)菌株必須具備很強的對自身代謝產(chǎn)物的耐受性[14]。文獻報道，雀稗麥角菌和黑麥麥角菌中的生物堿是由D-麥角酸通過一系列的酶催化反應最終生物合成麥角酰胺類或麥角肽堿。因此，增強菌株對麥角酸的耐受性，對于提高麥角酰胺的產(chǎn)量有重要意義。

經(jīng)UV及EMS復合誘變后，從出發(fā)菌株HY45-15篩選出一株丁二酸耐受菌株HY65-13。對比自然選育、復合誘變選育和麥角酸耐性選育結果，HY65-13效價卻比自然選育和復合誘變選育選育分別提高了15%和6%，具體數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 麥角菌73-9系譜圖Fig.1 Genealogical tree of HY73-9

2.6 麥角菌HY65-13遺傳穩(wěn)定性的考察

將高產(chǎn)菌株HY65-13進行傳代培養(yǎng)五代，傳代培養(yǎng)表明，經(jīng)推理選育的菌株，高產(chǎn)性狀遺傳穩(wěn)定，最后得到HY73-9，結果見表1。

2.7 麥角菌HY73-9 30 L發(fā)酵罐發(fā)酵結果

將推理選育的高產(chǎn)菌株HY73-9進行30 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，具體結果如圖2所示。

表1 復篩菌株的傳代穩(wěn)定性試驗結果Table1 Results of subculture of strains

圖2 麥角菌HY73-9 30 L發(fā)酵過程中各參數(shù)的變化Fig.2 Time courses of several parameters fermentation in 30 L fermentor with HY73-9

由圖2可知，發(fā)酵初期，發(fā)酵液pH基本維持在4.9～5.0之間（圖2B）。此時PMV快速增加，山梨醇以及氨基氮消耗很快，但是麥角酰胺產(chǎn)量不高，且波動不大（圖2A、2C），說明此時是菌體快速生長繁殖的階段。

隨后，pH小幅度上升，而PMV趨于平衡，這時山梨醇與氨基氮保持較快的消耗速度，而麥角酰胺的產(chǎn)量快速上升，說明此時已經(jīng)進入次級代謝階段。當發(fā)酵進行到第9天時，菌體濃度稍微下降，此時向發(fā)酵料液中補加2%的山梨醇，在第10天后，菌體濃度有回升的趨勢，這是由于碳源的補加而導致的菌體二次增長。此時，由于大部分菌體仍處于次級代謝階段，所以麥角酰胺的產(chǎn)量依舊持續(xù)的增加。

在第12天后，由于大部分的菌體老化，導致發(fā)酵液的pH上升以及菌體濃度下降。此時，山梨醇氨基氮消耗殆盡，但由于二次生長菌體仍可以利用前期的代謝中間產(chǎn)物，所以麥角酰胺產(chǎn)量依舊增加。在第15天后，pH達到5.35以上，菌體大部分發(fā)生自溶，麥角酰胺產(chǎn)量基本穩(wěn)定，發(fā)酵結束。最終麥角酰胺產(chǎn)量達到815 μg·mL-1。

3 討論與結論

關于麥角酰胺國內外研究很多，主要有：培養(yǎng)基優(yōu)化，傳統(tǒng)誘變育種，原生質體以及基因改造等。眾所周知，微生物育種產(chǎn)量的提高要實現(xiàn)質的飛躍主要是靠誘變育種，傳統(tǒng)育種工作量極大，原生質體技術雖然可以提高菌種的穩(wěn)定性，但是后續(xù)工作依舊是傳統(tǒng)誘變。目前關于基因改造能明顯提高菌種產(chǎn)量的報道很少。本菌種存在菌體不產(chǎn)孢和菌絲體質硬等問題，不論對于傳統(tǒng)的篩選還是原生質體誘變來說，菌體的大量處理都是一個很復雜的過程。本試驗從麥角酰胺生物合成過程出發(fā)，經(jīng)復合誘變后再通過不同篩選劑定向篩選出高產(chǎn)菌株，減少了工作量與篩選的盲目性，提高了效率。

相比之下，雖然本研究所采用的推理選育方法獲得的菌種穩(wěn)定性不如原生質體法，目的性沒有基因改造法強，但是推理選育方法減少了大量繁冗工作，所得菌株的產(chǎn)量顯著提高，傳代培養(yǎng)證明高產(chǎn)菌株具有很高的遺傳穩(wěn)定性。該方法不僅適用于麥角菌，也能廣泛應用于大規(guī)模的其他工業(yè)微生物選育，為提高工業(yè)微生物選育效率提供理論支持。

綜上所述，本試驗通過UV與EMS復合誘變，再經(jīng)過理性篩選，得到高產(chǎn)菌株HY73-9，證明了復合誘變后的菌株通過理性選育提高產(chǎn)量是一個切實可行的篩選方式；同時經(jīng)30 L發(fā)酵罐發(fā)酵，麥角酰胺的產(chǎn)量達到815 μg·mL-1，比原始菌株產(chǎn)量提高了172%，可為工業(yè)化生產(chǎn)麥角酰胺提供理論參考。

[1]Brown H B.Life history and poisonous properties of Claviceps paspali[J].Journal of Agricultural Research,1916,7:9-10.

[2]Mukherjee J,Menge M.Progress and prospects of ergot alkaloid research[J].Advances in Biochemical Engineering,2000,68(5):l-20.

[3]Ricicová A,Flieger M,Rehácek Z.Quantitative changes of the alkaloid complex in a submerged culture of Claviceps paspali[J].Folia Microbiologica,1982,27(6):433-445.

[4]Rylko V,Linhartová R,Sajdl P,Rehácek Z.Formation of conidia in a saprophytic strain Claviceps paspali producing simple lysergic acid derivatives[J].Folia Microbiologica,1988,35(5):425-95.

[5]Boiehenko L V,Boiehenko D M,Vinokurova N G.Use of polymerase chain reaction for searching for producers of ergot alkaloids from among mieroseopic fungi[J].Microbiology,2001,70(8):360-364.

[6]Menge M,Mukherjce J,Seheper T.Applieation of oxygen vectors to Claviceps purpurea cultivation[J].Applied Microbiloby Biotechnology,2001,55(4):411-416.

[7]陳江源,代江紅,劉志國,等.麥角酰胺產(chǎn)生菌原生質體的紫外誘變育種[J].化學與生物工程,2005(7):33-45.

[8]何惠霞,朱平,李煥婁.ɑ-麥角隱亭產(chǎn)生菌的原生質體誘變育種[J].真菌學報,1966,15(3):215-219.

[9]王相晶,王曉舟,張繼,等.土壤多重抗生素抗性放線菌的篩選及其發(fā)酵產(chǎn)物的初步研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2011,42(2):84-91.

[10]車可舒,王相晶,向志丹.多殺菌素高產(chǎn)菌株的選育[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2011,39(8):74-76.

[11]Wang X J,Wang X C,Xiang W S.Improvement of milbemycin-producing Streptomyces bingchenggensis by rational screening of ultraviolet and chemically induced mutants[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2009,25:1051-1056.

[12]趙慎飛.HPLC法測定甲磺酸雙氫麥角毒堿注射液中有關物質[J].海峽藥學,2008,20(4):32-34

[13]袁曉環(huán).高效液相色譜法測定山梨醇含量[J].齊齊哈爾大學學報,2001,17(3):15-21.

[14]朱平.麥角生物堿生物合成研究進展[J].藥學學報,2000,35(8):630-634.

[15]王亞林,趙靜國,熊萬斌.產(chǎn)麥角堿麥角菌發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J].武漢工業(yè)學院學報,2003,22(2):1-3.

[16]劉志國,王亞林,趙靜國.雀稗麥角菌產(chǎn)麥角堿發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].化學與生物工程,2004(2):18-21.

[17]施巧琴,吳松剛.工業(yè)微生物育種[M].北京:科學出版社,1991:242-243.

[18]胡晨曦,楊金玲,程克棣,等.麥角堿生物合成途徑中酶學及相關基因研究進展[J].西北植物學報,2005,25(4):819-828.

[19]Spalla C,Filippini S,Grein A.A hypothesis on the regulation mechanisms governing the biosynthesis of alkaloids Claviceps[J].Folia Microbiologica,1978,23:505-508.