長(zhǎng)期定位施肥黑土富里酸與Cu（Ⅱ）配位能力的研究

魏自民，趙富陽(yáng)，魏 丹，周寶庫(kù)，李艷平，李書(shū)玲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境研究所，哈爾濱 150086）

長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)是指超過(guò)20年研究作物生產(chǎn)、養(yǎng)分循環(huán)和農(nóng)業(yè)環(huán)境效應(yīng)的田間試驗(yàn)[1]。它能克服短期培肥試驗(yàn)受當(dāng)年環(huán)境因素影響，為探討施入土壤中磷肥和有機(jī)肥的轉(zhuǎn)化、去向、有效性、消耗和積累等提供技術(shù)條件。腐殖酸廣泛存在于土壤、水和沉積物中，是一種含有多功能基的聚電解質(zhì)，具有相當(dāng)量的多種離子與放射性核物質(zhì)[2-5]結(jié)合能力，對(duì)各種金屬離子在自然界中的遷移、固定和聚集有重要作用[6]。目前已有高效液相色譜、離子選擇電極、熒光光譜分析等多種研究方法[7]應(yīng)用于對(duì)有機(jī)質(zhì)與重金屬作用的研究。由于熒光光譜法具有靈敏度高、快速、定性、定量、實(shí)驗(yàn)易于操作等特點(diǎn)，且在水溶液中濃度低條件下易被檢測(cè)到，被廣泛應(yīng)用于腐殖酸領(lǐng)域的研究。國(guó)內(nèi)外對(duì)于不同來(lái)源的FA分子與重金屬離子間相互反應(yīng)的研究報(bào)道比較多[8-10]，但對(duì)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期定位施肥后黑土FA于Cu（Ⅱ）之間相互作用關(guān)系報(bào)道較少。本研究運(yùn)用熒光光譜分析方法，對(duì)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期施加不同肥料的黑土中的FA與Cu（Ⅱ）的絡(luò)合能力進(jìn)行分析，以期研究長(zhǎng)期施加不同肥料對(duì)黑土性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)土壤樣品于2009年5月取自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，試驗(yàn)分4個(gè)施肥處理，分別為CK、NPK（無(wú)機(jī)肥處理）、MNPK（有機(jī)無(wú)機(jī)肥混施處理）、OM（有機(jī)肥處理）。試驗(yàn)田2009年已達(dá)30個(gè)生長(zhǎng)季。1980年按小麥-大豆-玉米順序輪作，每個(gè)處理小區(qū)面積168 m2，每區(qū)8壟，壟長(zhǎng)30 m，壟距70 cm。對(duì)小麥和玉米施肥量為：N 150 kg·hm-1，P2O575 kg·hm-1，K2O 75 kg·hm-1；對(duì)大豆施肥量為：N 75 kg·hm-1，P2O5150 kg·hm-1，K2O 75 kg·hm-1；有機(jī)肥為純馬糞，每輪作周期施一次，施于玉米茬，按氮量75 kg·hm-1（約馬糞18.6 t·hm-1），以M表示。氮肥為尿素，磷肥為重過(guò)磷酸鈣、磷酸氫二銨，鉀肥為硫酸鉀。

1.2 土壤富里酸（FA）的提取

1.2.1 腐殖質(zhì)的提取

樣品大約30 g用0.1 mol·L-1Na2P2O7+0.1 mol·L-1NaOH的混合液按固液比1∶5振蕩（150 r·min-1）浸提24 h，0.45 μm纖維樹(shù)脂濾膜，收集濾液。

1.2.2 FA的分離純化

將1.2.1中濾液用6 mol·L-1HCl將pH調(diào)至1.0，在4℃中靜置過(guò)夜后，過(guò)濾后過(guò)0.45 μm纖維樹(shù)脂濾膜，得上清液及沉淀，上清液過(guò)XAD8-HP大孔吸附樹(shù)脂及氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂后，得FA組分。

1.2.3 FA與Cu（Ⅱ）配位反應(yīng)平衡液制備

取8個(gè)50 mL錐形瓶，每瓶中均加入15 mg·L-1所制備濾液20 mL，分別滴加濃度為0.01 mol·L-1或0.001 mol·L-1Cu（NO3）2溶液，8 個(gè)錐形瓶中的 Cu（Ⅱ）濃度依次為0、10、20、30、40、50、60、70 μmol·L-1，使用兩種濃度（0.1 mol·L-1和0.01 mol·L-1）的HClO4和NaOH溶液調(diào)各樣品pH為8.0±0.05，加入的酸堿試劑總量不超過(guò)100 μmol，忽略濃度稀釋效應(yīng)，在恒溫震蕩器中30℃、180 r·min-1避光震蕩24 h，相同溫度下再避光靜止4 h，待反應(yīng)平衡后，進(jìn)行光譜測(cè)定。

1.3 光譜學(xué)分析

1.3.1 熒光光譜測(cè)定

熒光光譜測(cè)定采用儀器為Perkin Elmer Luminescence Spectrometer LS50B。該儀器的主要性能參數(shù)如下：激發(fā)光源：150-W氙弧燈；PMT電壓：700 V；信噪比＞110；帶通（Bandpass）：Ex=10 nm；Em=10 nm；響應(yīng)時(shí)間：自動(dòng)；掃描光譜進(jìn)行儀器自動(dòng)校正。各熒光光譜的掃描參數(shù)：熒光發(fā)射光譜：發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為Eem=250～750 nm，固定激發(fā)波長(zhǎng)Eex=360 nm；熒光激發(fā)光譜：激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍為Eex=370～600 nm，固定發(fā)射波長(zhǎng)Eem=560 nm；同步掃描光譜：波長(zhǎng)掃描范圍為Eex=200～600 nm，Δλ=Eem-Eex=18 nm，上述三種傳統(tǒng)熒光光譜測(cè)定時(shí)的掃描速度均為200 nm·min-1。

1.3.2 熒光猝滅方程計(jì)算配位比例系數(shù)及表觀穩(wěn)定常數(shù)計(jì)算

利用修正型Stern-Volme方程[11-12]：F0/（F0-F）=1/（fK[Cu]）+1/f，其中f是能與Cu離子結(jié)合的熒光基團(tuán)的比例，K是絡(luò)合反應(yīng)的表觀穩(wěn)定常數(shù)，F(xiàn)0為初始熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為猝滅后的熒光強(qiáng)度。在上式中如F0/（F0-F）與1/[Cu]成線性關(guān)系可求出表觀穩(wěn)定常數(shù)K和參加配位的熒光基團(tuán)比例f。

2 結(jié)果與分析

2.1 FA與Cu（Ⅱ）相互作用的傳統(tǒng)熒光光譜特性

2.1.1 發(fā)射光譜

由圖1可以看出，不同處理熒光發(fā)射光譜圖譜形狀較為類似。但各峰強(qiáng)度不同，相似的熒光基團(tuán)以不同比例存在于各處理FA分子中。在掃描波長(zhǎng)范圍內(nèi)，隨著溶液中Cu（Ⅱ）濃度升高，F(xiàn)A熒光強(qiáng)度依次下降。加入Cu（Ⅱ）后440 nm主峰未發(fā)現(xiàn)明顯位移。低濃度Cu（Ⅱ）可明顯起到對(duì)FA的熒光猝滅效應(yīng)，而當(dāng)Cu（Ⅱ）濃度達(dá)到一定程度時(shí)反應(yīng)趨于達(dá)到平衡。與CK處理相比較施肥后低濃度的Cu（Ⅱ）更能起到對(duì)FA熒光猝滅作用，特別是M，MNPK處理在Cu（Ⅱ）濃度達(dá)到60 μmol·L-1時(shí)反應(yīng)已明顯接近飽和，長(zhǎng)期定位施肥后（特別是施加M，MNPK肥）土壤FA與Cu（Ⅱ）間反應(yīng)更強(qiáng)烈。

圖1 各處理FA與Cu(Ⅱ)離子作用的發(fā)射光譜Fig.1 Emission spectrum of each FA after Cu(II)added

2.1.2 激發(fā)光譜

由圖2可知，不同處理圖譜形狀基本相似，均在458、392 nm附近各產(chǎn)生一個(gè)熒光峰。392 nm處的熒光峰與木質(zhì)素降解產(chǎn)物酚結(jié)構(gòu)上的羥基有關(guān)，458 nm處熒光峰來(lái)源于苯環(huán)上的供電子基團(tuán)（-OH、-NH2等），加入Cu（Ⅱ）后，392、458 nm處熒光強(qiáng)度劇烈下降，表明FA中的-OH、-NH2等基團(tuán)與Cu（Ⅱ）發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)。低濃度Cu（Ⅱ）可對(duì)FA熒光猝滅效果，而當(dāng)Cu（Ⅱ）濃度達(dá)到一定程度時(shí)反應(yīng)趨于平衡。施肥后458 nm熒光峰猝滅現(xiàn)象較392 nm熒光峰的猝滅現(xiàn)象劇烈，這表明施肥后FA的偏復(fù)雜結(jié)構(gòu)（苯環(huán)上的供電子基團(tuán)：-OH、-NH2）與Cu（Ⅱ）間發(fā)生較強(qiáng)烈的反應(yīng)。

2.1.3 同步掃描光譜

由圖3可見(jiàn)，加入Cu（Ⅱ）后470、430、390 nm主峰沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的位移。低濃度Cu（Ⅱ）可明顯起到對(duì)FA的熒光猝滅效應(yīng)，而當(dāng)Cu（Ⅱ）濃度達(dá)到一定程度時(shí)反應(yīng)趨于達(dá)到平衡。Cu（Ⅱ）濃度為10 μmol·L-1時(shí)所有處理FA分子的470 nm峰下降得均較明顯，當(dāng)Cu（Ⅱ）濃度繼續(xù)升高時(shí)施肥后的FA 470 nm峰的猝滅現(xiàn)象更為顯著（在Cu（Ⅱ）濃度達(dá)到70 μmol·L-1時(shí)此峰趨于消失），尤其是施加MNPK肥后470 nm峰由最高峰降為最低峰，這表明施肥后（尤其是施加MNPK肥）FA分子中的偏復(fù)雜結(jié)構(gòu)能與Cu（Ⅱ）發(fā)生較強(qiáng)烈反應(yīng)。

2.2 猝滅類型的確定

靜態(tài)猝滅發(fā)生于猝滅劑與熒光物質(zhì)的基態(tài)分子間。靜態(tài)猝滅改變了熒光物質(zhì)的熒光特性而造成激發(fā)光譜的位移。加入Cu（Ⅱ）后392、458 nm主峰沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的位移，意味著Cu（Ⅱ）與FA的絡(luò)合反應(yīng)屬于動(dòng)態(tài)猝滅（見(jiàn)圖4）。

2.3 熒光猝滅方程

表1為根據(jù)動(dòng)態(tài)猝滅方程計(jì)算出的Cu（Ⅱ）與FA分子間的配位表觀穩(wěn)定常數(shù)及配位比例系數(shù)。

Cu（Ⅱ）與各處理FA的配位比例由高至低順序?yàn)椋篗NPK（0.95）＞NPK（0.93）＞M（0.92）＞CK（0.81），與CK相比較MNPK處理后的FA與Cu（Ⅱ）的配位比例提高了17.2%，NPK處理后的FA與Cu（Ⅱ）的配位比例提高了14.8%，M處理后的FA與Cu（Ⅱ）的配位比例提高13.6%。以上數(shù)據(jù)表明施肥（特別是施加MNPK肥）有更多Cu（Ⅱ）可結(jié)合到FA分子。

圖2 各處理FA與Cu(Ⅱ)離子作用的激發(fā)光譜Fig.2 Excitation spectrum of each FA after Cu(II)added

圖3 各處理FA與Cu(Ⅱ)離子作用的恒波長(zhǎng)同步光譜Fig.3 Sy spectrum of each FA after Cu(II)added

Cu（Ⅱ）與各處理FA反應(yīng)的表觀穩(wěn)定常數(shù)由高至低順序?yàn)椋篗（0.043）＞NPK（0.043）＞CK（0.035）＞MNPK（0.020）。與CK相比較M，NPK處理后的FA與Cu（Ⅱ）反應(yīng)的表觀穩(wěn)定常數(shù)提高了22.8%，而MNPK處理后的FA與Cu（Ⅱ）反應(yīng)的表觀穩(wěn)定常數(shù)降為原來(lái)的57.1%。施加M或NPK肥料均提高Cu（Ⅱ）與土壤FA分子間反應(yīng)的表觀穩(wěn)定常數(shù)即Cu（Ⅱ）與土壤FA分子間的反應(yīng)更為穩(wěn)定，而當(dāng)施加MNPK肥料時(shí)土壤FA與金屬離子間的表觀穩(wěn)定常數(shù)降低。

圖4 溫度對(duì)FA與Cu(Ⅱ)間反應(yīng)能力的影響Fig.4 Effect of temperature on the reactivity ability between FA and Cu(Ⅱ)

表1 加入離子后FA的配位比例與表觀穩(wěn)定常數(shù)Table1 Coordination ratio and stability constant of FA after Cu(II)added

3 結(jié)論

a.與CK處理相比較施肥后低濃度的Cu（Ⅱ）對(duì)FA熒光猝滅作用更強(qiáng)，特別是M、MNPK處理在Cu（Ⅱ）濃度達(dá)到60 μmol·L-1時(shí)反應(yīng)已明顯接近達(dá)到飽和，這意味著經(jīng)長(zhǎng)期定位施肥后（特別是施加M，MNPK肥）土壤FA與Cu（Ⅱ）間的反應(yīng)更加強(qiáng)烈。

b.激發(fā)光譜顯示施肥后458 nm熒光峰的猝滅現(xiàn)象較392 nm熒光峰的猝滅現(xiàn)象劇烈，這表明施肥后FA的偏復(fù)雜結(jié)構(gòu)與Cu（Ⅱ）間發(fā)生較強(qiáng)烈反應(yīng)。

c.同步掃描光譜顯示在Cu（Ⅱ）濃度較高時(shí)施肥后的FA470 nm峰的猝滅現(xiàn)象更為顯著（尤其是施加MNPK肥后470 nm峰由最高峰降為最低峰），這表明施肥后（尤其是施加MNPK肥）FA分子中的偏復(fù)雜結(jié)構(gòu)能與Cu（Ⅱ）發(fā)生較強(qiáng)烈的反應(yīng)。

d.施加NPK肥料即可提高FA與Cu(Ⅱ)間的配位比例系數(shù)又可提高二者間的表觀穩(wěn)定常數(shù)，亦表明有更多的Cu（Ⅱ）離子能夠更加穩(wěn)定的結(jié)合到長(zhǎng)期施用NPK肥料后的FA分子上。

e.雖然施加MNPK肥料的FA與Cu（Ⅱ）間的配位比例系數(shù)最高，但二者間反應(yīng)的表觀穩(wěn)定常數(shù)明顯下降，這意味著施加MNPK肥料后的FA能夠結(jié)合Cu（Ⅱ）的數(shù)量最多，但二者的結(jié)合并不穩(wěn)定。

[1]Rasmussen Paul E,Keith W T Goulcling,James R,et al.Longterm agroecosysterm experiments:Assessing agricultural sustainability and global change[J].Science,1998,282:893-896.

[2]Takumi Saito,Luuk K Koopal,Shinya Nagasaki,et al.Electrostatic potentials of humic acid:Fluoresence quenching measurements and comparison with modal calculations[J].Colloids and Surfaces A:Physicochem,Eng,Aspects,2009,347:27-32.

[3]Milne C J,Kinniburgh D G,Riemsdijk W H,et al.Generic NICADonnan model parameters for metalion binding by humic substances[J].Environ Sci Technol,2003,37:958-995.

[4]Mccarthy J F,Zachara J M,Subsurface transport of contaminantsmobile colloids in the subsurface envirment may alter the transport of contaminants[J].Environ,Sci,Technol,1989,23:496-502.

[5]Seo D J,Kin Y J,Ham S Y,et al.Characterization of dissolved organic matter in leachate discharged from final disposal sites which contained municipal solid waste incineration residues[J].Journal of Hazardous Materials,2007,148:679-692.

[6]俞天智,幐秀蘭,張子瑜,等.用熒光光譜研究腐殖酸與金屬離子Al3+的配合作用[J].環(huán)境化學(xué),1999,18:3-6.

[7]Gaffney J S,Marley N A,Clark S B,Humic fulvic acids organic colloidal materials in the environment[C]//Gaffney J S,Marley N A,Clark S B.Humic and Fulvic Acids.American Chemical Society,1996,50:1-16.

[8]Christensen J B,Jensen D L,Gron Christian,et al.Characterrization of the dissolved organic carbon in landfill leachatepolluted groundwater[J].Water Res,1998,32:125-135.

[9]Hernandez D,Plaza C,Senesi N,et al.Detection of copper(Ⅱ)and zinc(Ⅱ)binding to humic acids pig slurry and amended soils by fluorescence spectroscopy[J].Environ Pollut,2006,143:212-220.

[10]Imai A,Fukushima T,Matsushige K,et al.Characterization of dissolved organic matter in effluents from wastewater treatment plants[J].Water Res,2002,36:859-870.

[11]Joaquim C G,Esteves da Silva,Adelio A S C,et al.Fluorescence quenching of anthropogenic fulvic acids by Cu(Ⅱ),Fe(Ⅲ)and UO22+[J].Talanta,1998,45:1155-1165.

[12]Buffle J.Complexation reactions in aquatic systems:An analytical approach[J].Ellis Horwood,Chichester,1985.