脂肪干細胞研究進展

吳海濤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210046）

長期以來，脂肪組織被認為是惰性組織，主要致力于能量儲存與釋放。近年的研究表明，脂肪組織不僅參與內(nèi)分泌和免疫調(diào)控，還含有具備多向分化潛能的多能干細胞。2004年國際脂肪應(yīng)用技術(shù)協(xié)會 （International Fat Applied Technology Society）將此干細胞命名為脂肪來源干細胞（Adipose-derived Stem Cell，ASC）[1]，因為來源于中胚層間充質(zhì)，也常將其稱為脂肪間充質(zhì)干細胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cell，AMSC）。

目前常用的干細胞包括胚胎干細胞、成體干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞。因為面臨倫理、法律和政治爭議，人體胚胎干細胞一般不可用于當前的醫(yī)療實踐。中胚層來源的骨髓干細胞是最早研究的成體多能干細胞，已廣泛用于組織工程，但它來源有限，抽取骨髓時有疼痛，而且從骨髓組織中提取的干細胞比例非常低（大約每105個黏附間質(zhì)細胞可獲得1個干細胞）；臍帶血干細胞也屬于成體多能干細胞，其分化潛能低于骨髓干細胞，且需要長期保存；而脂肪干細胞可以從脂肪組織抽吸物中大量分離獲取，而且容易培養(yǎng)、生長速度快、衰老也比骨髓干細胞慢，另外，其致病性低、分化穩(wěn)定、移植安全的特點使其成為基礎(chǔ)和臨床研究中理想的成體干細胞。

1 脂肪干細胞的分離

吸脂術(shù)產(chǎn)生的脂肪吸取物是自體ASC的理想來源，從脂肪吸取物原代培養(yǎng)得到的細胞稱為脂肪基質(zhì)微管碎片細胞（SVF），這種細胞不僅含有脂肪干細胞，還包括內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、周細胞、成纖維細胞、白細胞、造血干細胞、內(nèi)皮祖細胞等[2]。在細胞培養(yǎng)過程中，ASC 通過與塑料培養(yǎng)皿粘附而與其它細胞分離[3]，但是成纖維細胞也會和塑料培養(yǎng)皿壁粘附，所以，一些批評意見指出，如果存在造血干細胞污染，那么細胞分化的來源就不是單一的。

2 脂肪干細胞的培養(yǎng)特性

骨髓干細胞對胎牛血清的來源和質(zhì)量有嚴格要求，而脂肪干細胞在添加任何批號胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中均能很好地擴增，細胞形態(tài)成纖維狀，傳代培養(yǎng)平均倍增時間為60小時，并且保持穩(wěn)定的倍增率直至13～15 代，其中衰老和死亡細胞的比例也很低，這表明ASC 體外擴增能力很強，易于獲得大量有分化能力的細胞。但是Rubio 等人發(fā)現(xiàn)[4]，人類ASC 連續(xù)增殖傳代超過4個月后，將出現(xiàn)惡變現(xiàn)象，提示新提取的ASC 較培養(yǎng)傳代后的ASC 更安全、更適合用于臨床。

3 脂肪干細胞表面的分子標記

特異性細胞表面的分子標記有助于ASC的純化、鑒定以及進一步研究，但大量實驗結(jié)果表明ASC 細胞表面分子標記存在異質(zhì)性[5]，不同研究小組報道的分子標記有差異，這與ASC 細胞純化和培養(yǎng)方法不同以及分子標記檢測時細胞處于不同的階段有關(guān)。

大多數(shù)研究人員通過原代培養(yǎng)得到的SVF 細胞是異源的細胞混合物，其中的ASC 會通過和塑料培養(yǎng)皿壁粘附而與其他細胞分離，所以伴隨細胞生長、傳代，造血干細胞的分子標記CD11、CD14、CD45 會逐步喪失[6]；而利用塑料培養(yǎng)皿進行ASC培養(yǎng)時，一些分子標記也極易發(fā)生變化，比如粘附分子；研究還表明ASC 和骨髓干細胞有相似的分子標記[7]，一些骨髓干細胞分子標記也可以作為ASC的分子標記，比如STRO1、CD73[8]，但是它們?nèi)匀徊皇翘禺愋苑肿訕擞?。不過已有實驗結(jié)果表明ASC細胞是SVF 細胞中的CD34+、CD31-細胞群[9]。但目前ASC 細胞仍然只能通過功能實驗或者后續(xù)的分化結(jié)果加以確切鑒定。

4 脂肪干細胞的多向誘導(dǎo)分化

多能ASC 細胞可以分化為多種中胚層來源的細胞類型，包括骨骼肌、心肌、軟骨、脂肪、成骨等分化方向，其中心肌分化的重復(fù)性和產(chǎn)量是最低的[10]。在軟骨分化方面，ASC 不如骨髓干細胞有效[11]。來源于中胚層的脂肪干細胞分化為外胚層起源的神經(jīng)細胞[12]和內(nèi)胚層起源的胰腺表型細胞[13]是非常令人驚奇的，而且脂肪干細胞可能還有助于血管[14]和造血細胞的生成[7]。

ASC 在不同成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其生長和分化存在極大的差異，比如牛血清促進細胞生長，馬血清則有助于細胞分化；轉(zhuǎn)化生長因子β、纖維生長因子2 增強ASC 細胞增殖卻對分化沒有作用，表皮生長因子被證實是抗分化因子；體外ASC 向不同細胞類型分化依賴于培養(yǎng)基中不同的添加劑，比如在含有地塞米松、β-甘油磷酸鈉、L-谷氨酰胺和維生素C的培養(yǎng)基中，ASC 經(jīng)過3～4周培養(yǎng)可以產(chǎn)生成骨反應(yīng)；添加胰島素、地塞米松、吲哚美辛、異丁基-甲基黃嘌呤的DMEM 培養(yǎng)液，可誘導(dǎo)ASC分化為脂肪細胞，其它分化方向的誘導(dǎo)條件見表1。另外，在組織工程領(lǐng)域，理想的支架有利于細胞貼附、生長和分化，最終形成組織。比如結(jié)合于膠原微球支架的ASC 可以表現(xiàn)出成骨與成脂方向的分化與增殖[15]，結(jié)合有硫酸軟骨素的聚乙二醇水凝膠也被應(yīng)用于促進ASC分化為軟骨細胞[16]。

5 脂肪干細胞的應(yīng)用研究

體外擴增的ASC 與生物材料結(jié)合，是實現(xiàn)修復(fù)較大器官組織缺損，重建缺損部位生理功能的新途徑。但是目前脂肪干細胞的應(yīng)用研究多是個案報道，臨床研究也處于Ⅰ期臨床的早期。以下對脂肪干細胞在不同方向的應(yīng)用研究作簡要闡述。

ASC 在分化為脂肪細胞的同時，還有助于血管生成，可以明顯提高脂肪移植后的長期存活率，ASC的成脂分化在面部輪廓整形、除皺等軟組織重建中發(fā)揮著重要的作用。

成熟脂肪細胞及其前體細胞均表達單純皰疹病毒的受體，體內(nèi)和體外實驗證明復(fù)制缺陷的單純皰疹病毒可以有效轉(zhuǎn)染脂肪細胞，攜帶的外源基因在脂肪細胞中亦能穩(wěn)定表達。故以脂肪細胞為靶細胞，復(fù)制缺陷單純皰疹病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有可能成為基因治療的一種方式[17]。

ASC的成骨分化，在臨床上可用于骨折和關(guān)節(jié)植骨融合的治療。2003年首次實驗證明將體外成骨分化后的大鼠ASC，重新植入皮下，8周后有骨骼形成[18]；2004年德國MacroPore Biosurgery 公司與德國Giessen 大學(xué)聯(lián)合對外公布了一項使用脂肪干細胞治療一名七歲女孩顱骨缺損的臨床報告。在這項手術(shù)中，因骨傷面積接近120 cm2，髂嵴來源的骨數(shù)量有限，自體脂肪組織干細胞被加入到患者髂嵴移植骨，然后均勻地敷在顱骨缺損部位，并固定兩片可降解的MacroPoreTM 保護膜，3個月后CT分析顯示新骨形成，并且顱骨創(chuàng)傷區(qū)周圍顱頂幾近完全連續(xù)[19]。

Rodriguez 等將正常人ASC 移植到Duchenne 型肌營養(yǎng)不良模型小鼠（抗肌營養(yǎng)不良蛋白缺陷）的脛骨前肌，6個月后，90%的脛骨前肌檢測到抗肌營養(yǎng)不良蛋白表達，50天時，在相鄰腓腸肌發(fā)現(xiàn)由脛骨前肌遷移而來的抗肌營養(yǎng)不良蛋白陽性肌纖維[20]。

注射ASC 到裸鼠缺血的后肢，后肢血流量和毛細血管密度明顯增加[14]。這和ASC分泌血管內(nèi)皮生長因子、肝細胞生長因子、腫瘤壞死因子β[14]等血管生成因子有關(guān)，不太可能是ASC直接分化為血管內(nèi)皮細胞。有報道指出，使用自體脂肪移植治療20 位放療后期因慢性組織缺血導(dǎo)致并發(fā)癥的患者，都表現(xiàn)出新血管形成等進行性組織再生現(xiàn)象[21]。盡管機制仍不明了，但這種方法也有可能用于治療微血管病變。

ASC 能表達、分泌巨噬細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子等造血相關(guān)細胞因子[7]。2003年報道腹腔注射ASC 可以挽救40%被輻射小鼠的生命，雖然效果較骨髓干細胞慢，但存活率和骨髓干細胞一樣；文章分析認為，ASC 促進了骨髓造血干細胞的增殖[22]，不過脂肪干細胞靜脈注射會出現(xiàn)輻射小鼠死亡[22]的現(xiàn)象。

脂肪干細胞用于治療復(fù)發(fā)性克羅恩瘺（recurrent Crohn’s f istulae）的Ⅰ期臨床已在馬德里LaPazUniversityHospital 進行[23]，4位患者的9 處瘺管進行自體ASC 接種治療，在每周隨訪的8 處瘺管中，6 處瘺管（75%）在8周內(nèi)完全治愈，無副作用發(fā)現(xiàn)，更多評價還有待于Ⅱ期臨床試驗的進行。

6 ASC 研究需要解決的問題

盡管有報道稱ASC 用于人體是安全的[24]，但是，也有研究指出植入ASC 會導(dǎo)致機體出現(xiàn)免疫抑制[19]，顯然這個問題需要進行大規(guī)模的臨床實驗加以證實。

除此之外，以下一些問題的解決將有助于ASC 在臨床實踐中的應(yīng)用。首先，特異性分子標記的發(fā)現(xiàn)可以從根本上改變ASC 細胞的純化和鑒定。其次，要建立可靠、快速、有效的細胞分化方案。ASC 脂肪分化大約需要兩周時間，成骨和軟骨分化時間更長且分化的細胞數(shù)量少。改進現(xiàn)有分化方法可從以下方面進行：不同細胞因子和生長因子的應(yīng)用、利用可靠有效的生物材料進行3-D 培養(yǎng)、更清楚了解細胞分化相關(guān)的受體配體以及細胞外基質(zhì)成分等。另外無血清細胞培養(yǎng)和分化方法的建立、可靠穩(wěn)定的動物模型實驗也是ASC 臨床應(yīng)用需要解決的問題。

令人鼓舞的是上述很多問題正在被解決，所以ASC 在未來臨床實踐中的廣泛應(yīng)用是令人期待的。

表1 ASC 向特異的細胞譜系分化的誘導(dǎo)條件

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