bFGF對人根尖牙乳頭干細胞成脂分化影響的研究

吳家媛，賈 謙，何文喜，李玉成，況 蓉，倪龍興，牛忠英

(1.第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院，陜西西安710032;2.遵義醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院，貴州遵義563003;3.北京解放軍第306醫(yī)院，北京100101)

根尖牙乳頭干細胞(stem cells from the apical papilla，SCAP)是存在于年輕恒牙根端組織中的具有比牙髓干細胞(dental pulp stem cell，DPSC)更強的群體倍增能力、端粒酶活性、遷移率及成牙本質能力的一類間充質干細胞［1－2］。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)對間充質干細胞(MSCs)具有誘導細胞趨化、促有絲分裂等作用，在MSCs早期分化和發(fā)育進程中發(fā)揮著重要的作用［3］。本課題組前期實驗結果顯示，bFGF在一定的濃度范圍內能抑制SCAP的成骨分化，增加細胞的STRO－1、Nanog、Sox2、Oct4 Rex1的表達，從而推測bFGF可維持SCAP的干性(Stemness)［4］。多向分化能力是干細胞生物特性之一，其能力的強弱在某種程度上提示干細胞多分化潛能的強弱。bFGF是否在成脂分化中也發(fā)揮著同樣的作用，尚未見文獻報道。而且關于bFGF對MSCs成脂分化的作用，相關研究結果也并不一致［5－7］。故本研究以體外培養(yǎng)的SCAP為對象，初步探討bFGF對SCAP成脂分化能力的影響，以期明確bFGF是否也能在成脂分化方向上維持SCAP的干性(Stemness)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

高糖DMEM培養(yǎng)基 (Gibco，美國);胎牛血清(Hyclone，美國);谷氨酰胺、胰島素、維生素C、DMSO 油紅 O、BrdU(sigma，美國);IBMX、MTT(A-lexis，美國);吲哚美辛(武漢遠成藥業(yè));相差顯微鏡(Leica DM 6000B)，Mastercycler PCR 儀(Eppendorf，德國);Ps250電泳儀(Savant，美國);BIO－RAD Gel－Doc 2000凝膠成像系統(tǒng);分光光度計(eppendorf，德國)。

1.2 方法

1.2.1 根尖牙乳頭干細胞(SCAP)的分離、培養(yǎng)及鑒定

收集16～22歲志愿者因正畸需要新鮮拔除的未發(fā)育完全的健康第三磨牙，立即用含雙抗(100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)的 PBS液反復清洗，分離根尖牙乳頭并剪碎后加入3 mg/mL的Ⅰ型膠原和4 mg/mL Dispase酶，37℃下輕輕震蕩消化1 h，PBS液洗兩遍后接種于6孔培養(yǎng)板，加入含 150 mL/L FBS的 α－MEM 培養(yǎng)基 (含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)，置 50 mL/L二氧化碳孵箱中37℃培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細胞生長匯合至80%時，2.5 g/L胰蛋白酶消化收集細胞，參照文獻［4］進行初步鑒定，并以有限稀釋法篩選克隆化生長的細胞，按1∶3比例進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 bFGF對SCAP成脂分化能力的影響

取生長狀態(tài)良好的第3代SCAP以2×104細胞密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，加入含150 mL/L FBS的α－MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。待細胞達到80%融合時，棄原液并隨機分為2組，實驗組加入2 mL含bFGF終末濃度為5 ng/mL的成脂誘導液(含100 mL/L FBS、0.5 mmol/L 異丁基甲基黃嘌吟、0.5 mol/L氫化可的松、60 mol/L吲哚美辛的α－MEM);對照組加入相同體積不含bFGF的成脂誘導液繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液。誘導培養(yǎng)3周后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化以及脂肪滴形成情況;油紅O染色，相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 RT－PCR 檢測脂肪細胞標記基因 PPAR－γ2

取生長狀態(tài)良好的第3代SCAP，按1.2.2方法分為實驗組和對照組，分別在含或不含bFGF(5 ng/mL)的成脂誘導液中進行誘導培養(yǎng)，每3 d換液1次。分別于培養(yǎng)1周和3周，用RNAiso核酸提取試劑盒提取各組細胞的總 RNA;取2 μg總RNA逆轉錄合成cDNA。參照文獻［8］設計引物并由北京華大基因公司合成，引物序列分別為PPAR－γ2:5’－CAT TCT GGC CCA CCA ACT T－3’(上游)和 5’－CCT TGC ATC CTT CAC AAG CA－3’(下游);GAPDH:5’－GTC AAG GCC GAG AAT GGG AA－3’(上游)和 5’－GCT TCA CCA CCT TCT TGA TG－3’(下游)。取 2 μL CDNA 在 20 μL總反應體系中進行RT－PCR擴增，反應條件:94℃30 s，65 ℃延長1.5 min，循環(huán)30 次，72 ℃延伸10 min結束反應。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，于凝膠成像系統(tǒng)上照相并進行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 SCAP 原代培養(yǎng)

人第三磨牙根尖牙乳頭呈粉紅色，硬度中等，易從根尖孔剝離(圖1a)。酶消化法原代培養(yǎng)3 d即可觀察到細胞貼壁生長，貼壁細胞伸展后呈成纖維細胞樣，體積較小，胞體豐滿，胞核位于中央，形態(tài)較均一;少數(shù)可見方形、橢圓形和多角形，細胞呈巢狀或集落狀生長(圖1b、c)。

2.2 bFGF對SCAP成脂分化能力的影響

經成脂誘導3周后，鏡下可見對照組的細胞密度少于實驗組(bFGF組)，細胞拉長呈條狀生長，體積變大，細胞胞漿內及胞外可見圓形折光性脂滴形成;實驗組的細胞體積小，胞漿立體，細胞呈梭形，方形或多角形，細胞線行排列，細胞有圓形折光性脂滴形成(圖2a、b)。油紅O染色觀察，兩組均可見脂滴形成，其中實驗組脂滴染色面積較多，胞內外均可見脂滴形成，且有部分脂滴融合。對照組細胞體積較大，雖胞內外均有大量脂滴形成，但數(shù)量少于實驗組(圖2c、d)。

圖1 SCAP的原代培養(yǎng)

圖2 成脂誘導3周細胞形態(tài)及油紅O染色觀察

圖3 RT－PCR檢測PPAR－γ2 mRNA表達

2.3 RT－PCR 檢測PPAR－γ2 mRNA 表達情況

SCAP成脂誘導培養(yǎng)1周時，實驗組(bFGF組)PPAR－γ2 mRNA表達低于對照組，但二者間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);誘導3周時，實驗組中的PPAR－γ2 mRNA表達量明顯高于對照組，兩組間灰度值比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3)。

3 討論

多向分化和自我更新是干細胞干性的特征性表現(xiàn)，研究表明BMSC向成骨和成脂分化通常維持在一個平衡水平，一旦成骨分化較多，則成脂分化就會相應減少［9］。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－ activated receptor－ γ2，PPAR－γ2)基因是脂肪細胞分化標志性基因［10］。PPAR－γ2過表達時能促使成纖維細胞系的成脂轉化，而PPAR－γ2缺陷鼠的胚胎干細胞及胚胎成纖維細胞則無成脂分化能力。故通過檢測PPAR－γ2的表達可間接反映細胞的成脂分化能力。本實驗中在成脂誘導3周后，實驗組SCAP中的脂滴形成數(shù)量多于對照組，而且細胞密度相對較大，細胞體積小，未見拉長及變大等現(xiàn)象。RT－PCR檢測PPAR－γ2基因表達水平發(fā)現(xiàn)，誘導培養(yǎng)1周時，2組基因表達無顯著性差異;3周時實驗組PPAR－γ2基因表達明顯高于對照組。表明bFGF長時間作用于SCAP并進行成脂誘導時能使其維持特異性基因的表達，提示bFGF具有提高SCAP成脂分化的潛能。

研究報道，bFGF對4、6、9代人骨髓MSC成脂誘導無影響，bFGF組的PPAR－γ2基因表達直到9代仍保持與未添加bFGF類似的水平［11］。但以上實驗中未對PPAR－γ2基因的表達做定量分析，其所得結論尚有待進一步證實。而Neubauer等［12］在鼠MSC中研究則發(fā)現(xiàn)，bFGF可在鼠MSC分化的各個階段提高其成脂分化的能力和PPAR－γ2的表達。周媛等［5］也發(fā)現(xiàn)，bFGF能促進人MSCs向脂肪分化過程中PPAR－γ2的表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在成脂誘導中，添加5 ng/mL bFGF組(實驗組)的細胞數(shù)量一直在顯著增加，而且細胞依舊保持類似紡錘型，體積小而立體;而對照組中的細胞則有拉長、變大等現(xiàn)象，推測可能是由于誘導培養(yǎng)過程中bFGF作用于SCAP時能維持其干細胞基因的表達，某種程度上抑制了細胞的老化，進而抑制細胞功能的衰退，故在bFGF存在的情況下對SCAP進行長時間成脂誘導時可促進其PPAR－γ2 mRNA的表達。Colleoni等［13］也提出了相同的觀點，在其研究中發(fā)現(xiàn)，bFGF可抑制脂肪干細胞在誘導分化中發(fā)生衰老和形態(tài)改變，提示細胞在體外長時間培養(yǎng)時，bFGF可通過抑制細胞老化而維持其分化潛能。Amit等［14］發(fā)現(xiàn)，bFGF刺激 hESCs能持續(xù)其增殖，卻不促進其分化，但在含有bFGF和血清培養(yǎng)基中生長的hESCs相對小而密，形態(tài)更典型。

本研究結果表明，誘導早期bFGF對SCAP的成脂能力無影響，隨著誘導時間的延長，bFGF可促進PPAR－γ2的表達，提示其具有促進SCAP成脂分化的潛能。

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