高效液相色譜法檢測(cè)玉米及玉米葉中乙草胺的殘留量

劉曉明，郭平毅，馮翠萍，，王振

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

乙草胺，英文通用名為acetochl or，化學(xué)名稱(chēng)為2－乙基－6－甲基－N－乙氧基甲基－α－氯代乙酰替苯胺，分子式C14H20Cl NO2，分子量269.8，是一種選擇性芽前除草劑［1］，由美國(guó)孟山都公司于1971年開(kāi)發(fā)成功，是目前世界上最重要的除草劑品種之一［2］。該除草劑的特點(diǎn)是土壤處理后具有很高的活性，特別是對(duì)有機(jī)質(zhì)含量高的土壤更有效［3］，對(duì)一年生禾本科雜草、部分闊葉雜草等具有良好的防除效果 ，而對(duì)已出苗雜草無(wú)效［4］。乙草胺一直被認(rèn)為具有活性高、低毒、安全、殺草譜廣、適用作物寬和成本低廉等特點(diǎn)，是一種低毒的環(huán)境友好型農(nóng)藥，但過(guò)量、頻繁施用，也會(huì)造成一定的環(huán)境污染，美國(guó)環(huán)境保護(hù)局將乙草胺定為B－2類(lèi)致癌物，規(guī)定在1個(gè)月的監(jiān)測(cè)期，在20個(gè)監(jiān)測(cè)井的地下水中殘留濃度不得超過(guò)0.1 g·L－1［5］。

目前，乙草胺和阿特拉津的混合劑是廣泛用于玉米田的芽前選擇性除草劑，是我國(guó)最大的玉米田除草劑品種。目前國(guó)內(nèi)外的研究主要集中在乙草胺的殘留檢測(cè)及其在環(huán)境中的降解因素［6～10］，在推薦劑量以上對(duì)作物中乙草胺殘留分析還缺乏合理的試驗(yàn)依據(jù)。本文結(jié)合我國(guó)的實(shí)際情況，以乙草胺為檢測(cè)對(duì)象，以玉米和玉米葉為檢測(cè)材料，對(duì)乙草胺的殘留分析方法進(jìn)行改進(jìn)并對(duì)最終殘留量進(jìn)行測(cè)定，為其合理施用及安全評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 小區(qū)試驗(yàn)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站

供試藥劑：50%乙草胺乳油

供試品種：新農(nóng)早2號(hào)

施藥方法：手動(dòng)噴霧

本試驗(yàn)以6L·hm－2為殘留試驗(yàn)劑量。

1.1.2 試劑

色譜純甲醇、乙腈（美國(guó)Burdick﹠Jackson公司）；乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司，純度為97.3%）；田間供施50%乙草胺乳油（山東麒麟農(nóng)化有限公司）；甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷（均為國(guó)產(chǎn)分析純）。

1.1.3 儀器

Waters高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；固相萃取儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）；固相萃取柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）；TDL－40B（高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）；DHG－9243BS－Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜分析方法

色 譜 條 件：ODS－C18 柱 （250×4.6mm，5 μm）、紫外檢測(cè)波長(zhǎng)225nm、柱溫30℃、進(jìn)樣量：10 μL。保留時(shí)間：4.546min。

1.2.1.1 流動(dòng)相配比的篩選

使用乙腈、水作為流動(dòng)相，流速設(shè)為1mL·min－1，流動(dòng)相乙腈與水的比例選擇50∶50、60∶40、70∶30、80∶20，篩選合適的流動(dòng)相配比。

1.2.1.2 流速的篩選

將流動(dòng)相配比設(shè)為80∶20，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的流速為0.8mL·min－1，0.9mL·min－1，1.0mL·min－1，1.2mL·min－1，篩選合適的流速。

1.2.2 樣品前處理方法

1.2.2.1 固相萃取柱洗脫溶劑的選擇

取空白玉米植株6g，加入60mL甲醇，勻漿3 min，超聲波提取10min，過(guò)濾，殘?jiān)儆?0mL上述有機(jī)溶劑沖洗，合并上清液，40℃濃縮近干，殘?jiān)?mL的正己烷溶解，在溶解液中加入0.03mL 100mg·L－1乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液后，將其加入Florisil小柱凈化，用不同比例的洗脫液洗脫，過(guò)膜進(jìn)行色譜檢測(cè)，計(jì)算乙草胺的回收率，確定最佳洗脫液。

1.2.2.2 玉米葉前處理方法

剪成小段的玉米植株稱(chēng)取6g，分別加入60 mL有機(jī)溶劑乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇，勻漿3 min，超聲波提取10min，過(guò)濾，殘?jiān)儆?0mL上述有機(jī)溶劑沖洗，合并上清液，40℃濃縮近干，殘?jiān)?mL的正己烷溶解，柱凈化備用。

1.2.2.3 玉米籽粒的前處理方法

稱(chēng)取20g粉碎的玉米樣品于具塞三角瓶中，分別加入加60mL乙腈乙酸乙酯、乙腈、丙酮、甲醇，振蕩1h，超聲波提取15min，提取液經(jīng)濾紙過(guò)濾到蒸餾燒瓶，再加40mL提取劑溶解殘?jiān)?，超聲波提?0min，過(guò)濾，用10mL提取液清洗殘?jiān)?，合并兩次提取液和清洗劑于蒸餾燒瓶中，40℃濃縮近干，加5mL正己烷溶解，柱凈化備用。凈化步驟同1.2.2.1。

1.2.3 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配制成100μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)母液，再將此標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μg·mL－1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在4℃下保存待用。

1.2.4 殘留量的計(jì)算

樣品的殘留量計(jì)算公式：

式中：R：樣品中乙草胺殘留濃度／μg·g－1

Q：乙草胺標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度／μg·mL－1

S1：樣品色譜峰面積

S2：標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰面積

V2：樣品定容體積／mL

W：樣品稱(chēng)重／g

1.2.5 添加回收率

取空白植株6g，籽粒20g，分別添加0.01、0.1、0.5mg·kg－13個(gè)水平，重復(fù)3次，按照試驗(yàn)確定的樣品提取凈化方法和測(cè)定方法測(cè)定添加回收率。按色譜峰高是空白樣品基線(xiàn)噪聲高度3倍計(jì)算植株和籽粒中最低檢測(cè)限。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙草胺液相色譜條件的確定

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

由于乙腈的溶解強(qiáng)度較高且黏度小，采用乙腈∶水做流動(dòng)相。與甲醇∶水流動(dòng)相相比，乙腈：水系統(tǒng)的流動(dòng)相柱壓低，基線(xiàn)穩(wěn)定，測(cè)定成分與雜質(zhì)分離效果好。

分別用乙腈∶水50∶50、60∶40、70∶30、80∶20對(duì)標(biāo)樣檢測(cè)，通過(guò)色譜圖的比較，流動(dòng)相乙腈∶水＝60∶40時(shí)，峰形較好，保留時(shí)間適宜。由圖1可知，在此流動(dòng)相下，乙草胺的峰面積最大，所以選擇乙腈∶水＝60∶40做流動(dòng)相。

圖1 流動(dòng)相對(duì)峰面積的影響Fig.1 The effect of mobile phase

2.1.2 流速的選擇

隨著流速的增加，保留時(shí)間變小，由圖2可知，流速為1.0mL·min－1時(shí)，色譜峰峰面積大，占的比例最大，最終流速選擇1.0mL·min－1。

圖2 流速對(duì)峰面積的影響Fig.2 The effect of velocity

2.2 樣品前處理方法的確定

2.2.1 提取劑的選擇

乙草胺易溶于乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等有機(jī)溶劑。試驗(yàn)分別用上述溶劑提取植株和玉米中的乙草胺，發(fā)現(xiàn)乙腈、乙酸乙酯、丙酮的提取效率好，甲醇的提取率較差。但丙酮提取的油脂較多，與水互溶且溶解的色素較多，干擾雜質(zhì)多，不便于后續(xù)的凈化；乙腈溶解的油脂較少，所以確定玉米粒的提取劑為乙腈。玉米植株中含有一定的水分，而乙酸乙酯與水能很好的分層，有利于樣品的分離，采用乙酸乙酯為玉米植株的提取劑。

2.2.2 洗脫液的洗脫效果

從圖3中可以看出，隨著洗脫液中丙酮、乙酸乙酯比例的增加，洗脫下來(lái)的乙草胺量增多，當(dāng)丙酮、乙酸乙酯的量分別達(dá)到20%時(shí)，乙草胺的回收率均達(dá)到96%～98%，符合農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，洗脫液中乙酸乙酯、丙酮量的增加的同時(shí)，洗脫下來(lái)的色素量也在增加，相同比例下丙酮洗脫下來(lái)的色素比乙酸乙酯的多，所以選擇正己烷∶乙酸乙酯＝80∶20。

圖3 不同洗脫液的洗脫效果Fig.3 Different efficiency of different elution solvent

2.3 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

吸取1.2.3中乙草胺6個(gè)系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL，由低向高濃度分別進(jìn)樣。以注入的標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)得的峰面積Y為縱坐標(biāo)，回歸作圖，得到乙草胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖4。乙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的線(xiàn)性回歸方程為：Y＝279986X＋2143.9，R2＝0.9998。

圖4 乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.4 The standard curve of acetochlor

2.4 添加回收率和最低檢出限

取空白植株6g，籽粒20g，分別添加0.01、0.1、0.5mg·kg－13個(gè)水平，重復(fù)3次，按照試驗(yàn)確定的樣品提取凈化方法和測(cè)定方法測(cè)定添加回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知乙草胺在植株中的添加回收率為93.03%～98.24%，變異系數(shù)為1.113%～1.629%；玉 米籽粒 添 加 回 收 率為85.47% ～ 90.67%，變 異 系 數(shù) 為 1.497% ～2.177%?；厥章示笥?0%，滿(mǎn)足相關(guān)農(nóng)殘分析測(cè)定要求。按色譜峰高是空白樣品基線(xiàn)噪聲高度3倍計(jì)算，乙草胺在玉米葉和玉米籽粒中的最低檢測(cè)限為0.009mg·kg－1。

表1 添加回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recoveries of Classic from fortified samples（n＝3）

2.5 試驗(yàn)樣品的測(cè)定

按照本方法對(duì)植株和籽粒進(jìn)行分析，在此儀器條件下成熟期的玉米葉中并未檢測(cè)出乙草胺，成熟期的玉米籽粒中最終殘留量為0.030 51mg·kg－1。

3 結(jié)論與討論

乙草胺在玉米和玉米葉中的殘留分析方法。在借鑒國(guó)內(nèi)外有關(guān)乙草胺在其它作物中殘留分析方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行了改進(jìn)。對(duì)色譜條件、樣品提取劑、洗脫液比例等試驗(yàn)條件進(jìn)行研究和優(yōu)化，篩選出了最佳的檢測(cè)條件，所得試驗(yàn)方法滿(mǎn)足常規(guī)殘留分析要求。

（1）高效液相色譜法測(cè)定植株葉和籽粒中乙草胺的條件為：流動(dòng)相乙腈∶水為60∶40，流速1.0 mL·min－1，柱溫30℃。

（2）固相萃取柱有濃縮凈化提取液的作用，試驗(yàn)中采用的Florisil柱，屬于正相萃取柱，丙酮、乙酸乙酯對(duì)于Florisil柱都是強(qiáng)洗脫劑，但是在相同比例下丙酮洗脫下的雜質(zhì)比乙酸乙酯多。用正己烷∶乙酸乙酯作為洗脫液，可以達(dá)到凈化提取液的目的，明顯改善色譜分離，延長(zhǎng)色譜柱。

（3）乙草胺易溶于多種有機(jī)溶劑，在選擇提取劑時(shí)，考慮乙草胺所在基質(zhì)中的干擾成分。試驗(yàn)選擇玉米粒經(jīng)乙腈提取，玉米葉經(jīng)乙酸乙酯提取，這樣降低了淀粉和色素對(duì)提取率的影響。乙草胺在玉米和玉米葉中添加回收率分別為85.47%～90.67%和93.03%～98.24%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.497%～2.177%和1.113%～1.629%，滿(mǎn)足農(nóng)殘分析檢測(cè)要求。

（4）收獲期的玉米植株中未檢測(cè)出乙草胺，玉米籽粒中檢測(cè)到的乙草胺殘留量為0.030 51mg·kg－1，美國(guó)規(guī)定乙草胺在玉米谷物中的最大允許殘留限量值為0.05mg·kg－1。日本規(guī)定乙草胺在大豆中的MRL值為0.01mg·kg－1。建議在玉米田使用50%的乙草胺乳油不超過(guò)6L·hm－2。

［1］柳梅，王天斌，沈小德.我國(guó)乙草胺市場(chǎng)現(xiàn)狀及技術(shù)進(jìn)展［J］.化工技術(shù)經(jīng)濟(jì)，2005，23（3）：14－16.

［2］陳志石，李貴，吳競(jìng)侖.玉米田化學(xué)除草劑的發(fā)展及其在我國(guó)的應(yīng)用［J］.雜草科學(xué)，2008（2）：1－4.

［3］歐陽(yáng)天贊，葉發(fā)兵，胡先文.土壤處理除草刺的功效與歸趨［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（3）：29，31.

［4］王琪全，劉維屏.乙草胺和異丙草胺在土壤中吸附的研究［J］.土壤學(xué)報(bào)，2000，37（1）：95.

［5］Vijay M Kale，Sonia R Miranda，Mitchell S Wilbanks，et al.Comparative cytotoxicity of alachlor，acetochlor，and metolachlor herbicides in isolated rat and cryopreserved human hepatocytes［J］.Journal of biochemical and molecular toxicology，2008，22（1）：41－50.

［6］林麗白，陳家，陳小微，等.新型除草劑乙草胺原油的急性毒性研究［J］.中國(guó)職業(yè)醫(yī)學(xué)，1995，22：12－13.

［7］李恒，楊仁斌，盛莉莎，等.乙草胺在水稻環(huán)境中的殘留及消解動(dòng)態(tài)［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（2）：269－273.

［8］朱九生，喬雄梧，王靜，等.乙草胺在土壤環(huán)境中的降解及其影響因子的研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（5）：1025－1029.

［9］徐軍，邱星輝，曹宏.氯乙酰胺類(lèi)除草劑微生物降解研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004，10（3）：389－393.

［10］YE C.Environmental behavior of the herbicide acetochlor in soil［J］.Bulletin environmental contamination and toxicology，2003，71：919－923.