山西省番茄早疫病菌對腈菌唑的抗藥性監(jiān)測

史曉晶，韓巨才

（1.忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州034000；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

番茄早疫病又稱輪紋病，由茄鏈格孢菌（Alternaria solani Sorauer）侵染所致，各地普遍發(fā)生，是番茄的重要病害之一。該病還能為害馬鈴薯、茄子、辣椒等［1］。為有效防治該病，我國科研工作者在番茄早疫病的防治方面已做了大量的研究。在室內(nèi)，百菌清和百菌清三氟衍生物對番茄早疫病菌都有較好的抑制效果，但后者的效果明顯優(yōu)于前者［2］。在田間，50%異菌脲 WP、代森錳鋅、殺毒礬、百菌清、腐霉利、53.8%可殺得2000DF、苯醚甲環(huán)唑10%水分散粒劑對番茄早疫病有較好的防治效果［3～7］。經(jīng)過調(diào)查得知，山西省內(nèi)也有一些菜農(nóng)選用腈菌唑這類麥角甾醇生物合成抑制劑（SBIs）來防治番茄早疫病。

SBIs是一類防治農(nóng)作物真菌病害的內(nèi)吸性殺菌劑，可抑制病原菌細(xì)胞膜上麥角甾醇的生物合成。麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分，通過與磷脂結(jié)合而穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，具有調(diào)節(jié)膜流動性的功能，在確保膜結(jié)構(gòu)的完整性、與膜結(jié)合的酶的活性，細(xì)胞活力及物質(zhì)運輸?shù)确矫嫫鹬匾饔茫?］。同時其含量和組分的改變可影響真菌的繁殖。在SBIs被廣泛應(yīng)用8年后一些靶標(biāo)菌便產(chǎn)生了抗藥性［9］。早期研究認(rèn)為真菌對SBIs的抗藥性是由多基因控制的，且其適應(yīng)性差，在自然界很難形成抗性群體，故認(rèn)為病菌對SBIs產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險很?。?0］。但經(jīng)幾十年的研究發(fā)現(xiàn)病菌對SBIs的抗藥性并沒有人們預(yù)期的那樣樂觀，有關(guān)病菌對SBIs產(chǎn)生抗藥性的報道逐漸增加。

到目前為止國內(nèi)外關(guān)于番茄早疫病的研究主要在生物學(xué)特性、病菌生理分化現(xiàn)象、病害流行規(guī)律和化學(xué)防治等方面，在抗藥性方面集中在一些老藥劑上，還未見對腈菌唑抗藥性方面的報道［11］。故本文針對山西省各地區(qū)番茄早疫病菌進(jìn)行了抗腈菌唑監(jiān)測，了解抗藥性水平及抗性分布情況，以便合理用藥；同時進(jìn)行風(fēng)險評估，為及早研究和采取延緩或克服抗藥性治理策略奠定基礎(chǔ)。

1 供試材料與方法

1.1 供試菌株

從山西省晉中地區(qū)祁縣、晉南地區(qū)運城、晉東南地區(qū)長治、晉北地區(qū)大同和晉西北地區(qū)五寨5個地區(qū)，隨機取樣采集番茄早疫病病葉，于實驗室中分離。

1.2 供試殺菌劑

96.5%腈菌唑原藥，山東雙星農(nóng)藥廠。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL；

含藥培養(yǎng)基：取10.37mg腈菌唑溶于10mL丙酮溶液，配成10 000mg·L－1母液，使用時再配成所需濃度。一般以1mL藥液加入9mL培養(yǎng)基為宜，此比例不會影響培養(yǎng)基凝固（藥劑濃度被稀釋10倍）。培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時加入藥劑，混勻后制成含藥培養(yǎng)基。

1.4 菌種的采集與命名

番茄早疫病菌采自山西各地罹病的葉片。將所采樣品分別裝入小袋隔離，避免不同菌株間相互污染。菌株以“采樣地點（市或縣）的大寫拼音頭（聲母）＋序號”命名。

1.5 菌種的分離

在病健交界處切塊，依次用75%乙醇浸2～3s、15%次氯酸漂洗3min、無菌水洗滌3次后，接于PDA平板上，25℃培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子或菌絲為止，挑取孢子或菌絲，移到新PDA平板上。

1.6 番茄早疫病菌對腈菌唑敏感性的測定及敏感基線的建立

將腈菌唑母液用無菌水配制成100mg·L－1、50mg·L－1、25mg·L－1、12.5mg·L－1和6.25 mg·L－15種濃度，各取1mL分別與9mLPDA培養(yǎng)基混配，制成10mg·L－1、5mg·L－1、2.5 mg·L－1、1.25mg·L－1和0.625mg·L－1的含藥培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基冷卻后接入菌碟，菌面向下，每皿一塊，25℃培養(yǎng)5d，用十字交叉法測量菌落直徑。試驗重復(fù)3次。依據(jù)下式計算不同濃度對菌絲生長的抑制率：

以上數(shù)據(jù)均采用DPS軟件處理，求出毒力回歸方程和EC50值（mg·L－1）。

1.7 抗性菌株抗性水平和抗性頻率測定

將各地菌株的EC50與敏感基線比較，統(tǒng)計抗性水平，計算抗性頻率?？剐韵禂?shù)＝抗性菌株EC50／敏感菌株EC50，結(jié)果小于5為敏感菌株，5～20為低抗菌株，20～100為中抗菌株，大于100為高抗菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄早疫病菌對腈菌唑敏感基線的建立

在山西省5個調(diào)查地區(qū)共采集并分離到114個菌株，其中祁縣29個，運城28個，長治24個，大同18個，五寨15個，且全部可以使番茄葉片發(fā)病。

番茄早疫病菌寄主范圍雖然廣泛，但卻主要侵染蔬菜，尚未找到野生菌株，也未見該病菌對腈菌唑敏感基線的報道。山西省五寨縣地處偏遠(yuǎn)，從未用過腈菌唑，可將該地菌株作為相對敏感菌株，測得EC50值定為相對敏感基線（表1）為0.52mg·L－1，最低抑制濃度為5.0mg·L－1。

2.2 番茄早疫病菌對腈菌唑敏感性測定結(jié)果

由表2可見，大同、長治、祁縣分別有3株、9株、16株呈低抗水平；運城敏感菌株僅有6株，同時還出現(xiàn)了3株中抗菌株。結(jié)果表明：山西省大部分地區(qū)番茄早疫病菌對腈菌唑產(chǎn)生了不同程度的抗性，主要集中在低抗水平。

表1 五寨早疫病菌對腈菌唑敏感性的測定Table 1 Sensitivity to Myclobutanil of A.solani isolates in Wuzai

表2 山西省各地區(qū)番茄早疫病菌對腈菌唑抗性監(jiān)測Table 2 The resistance monitoring of A.solani isolates to Myclobutanil in five areas of Shanxi

從抗性頻率的總體上看（圖1，表2），山西省番茄早疫病菌的抗藥分布在各地區(qū)有所不同。運城（晉南地區(qū)）的總體抗性頻率最高，達(dá)78.57%，其中低抗菌株占相當(dāng)大的比例，為67.86%，中抗菌株為10.71%；祁縣（晉中地區(qū)）的低抗比例也較高，為55.17%；而大同（晉北地區(qū)）和長治（晉東南地區(qū)）的抗性菌株的比例均在50%以下。結(jié)果表明：腈菌唑的低抗菌株在群體中占相當(dāng)大的比例，已處于發(fā)展階段，應(yīng)采取有效措施加以控制。

圖1 山西省番茄早疫病菌對腈菌唑的抗性頻率Fig.1 Resistant frequency of A.solani isolates to Myclobutanil

3 結(jié)論與討論

本試驗測定了114株番茄早疫病菌對腈菌唑的敏感性，檢測到了敏感、低抗和中抗菌株。這些抗性菌株主要集中在晉南和晉中地區(qū)且都未形成規(guī)模，同時在這兩地也檢測到了敏感菌株，因此，可判斷山西省番茄早疫病菌還沒有對腈菌唑產(chǎn)生嚴(yán)重的抗藥性，但在適當(dāng)條件下會產(chǎn)生較大的影響，應(yīng)引起重視，應(yīng)對晉南和晉中地區(qū)早疫菌對腈菌唑的抗藥性情況進(jìn)一步跟蹤監(jiān)測，以確定其發(fā)展動態(tài)，從而判斷是否有產(chǎn)生嚴(yán)重抗藥性的危險，進(jìn)而及早采取有效措施防止其抗藥性的發(fā)展，延長腈菌唑的使用壽命。

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